質(zhì)粒的提取和鑒定,dna酶切(參考版)
2025-05-29 18:28本頁(yè)面
【正文】 （在波長(zhǎng) 260nm紫外光下， 1 OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈 DNA濃度為 50μg/ml；單鏈 DNA為 37 μg/ml；RNA為 40 μg /ml。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ? 雙鏈 DNA樣品濃度 (μg/μl) = OD260 核酸稀釋倍數(shù) 50/1000。紫外燈照射DNA片段不要超過(guò) 30秒。 DNA條帶充分分開后，在紫外燈下細(xì)心切取所要的 DNA條帶。l未酶切對(duì)照。l反應(yīng)液加入 6 loading buffer混勻于 ％瓊脂糖凝膠膠上 150伏電泳，約 30min。 4. 反應(yīng)結(jié)束后 70℃ 滅活 15min或者加入 EDTA至終濃度 10mM終止反應(yīng)。l 2. 將反應(yīng)體系充分混勻，并于臺(tái)式離心機(jī)上短暫離心收集液體。l H2O 4 181。l EcoRⅠ 1 181。g） 10 buffer M 2 181。 雙酶切實(shí)驗(yàn)材料 ? 限制性內(nèi)切酶： EcoRⅠ 、 XbaⅠ 和 HindⅢ ? DNA： λDNA和質(zhì)粒 pCDNAp38 ? 10 buffer H （ 37℃ , ） 90mM Tris?Cl 50mM NaCl 10M MgCl2 ? 10 buffer M（ 37℃ , ） 6mM Tris?Cl 100mM NaCl 6M MgCl2 ? 1mM DTT ? 10 BSA： 1mg/ml ? 無(wú)菌水 方法和步驟 1. 反應(yīng)體系配制： 質(zhì)粒 pCDNA3－ p38 10 181。 3. 酶解反應(yīng)時(shí)間 ： 根據(jù)酶的單位與 DNA用量之比來(lái)定，原則是酶 /DNA＝ 2~3， 12小時(shí)即可充分酶解。 5. DNA： 作為內(nèi)切酶的底物， DNA應(yīng)該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、 SDS和酒精等，這些因素的存在均在不同程度影響限制性內(nèi)切酶的活性。使用中一般以 1 181。 EcoRI Ⅱ 型限制與修飾系統(tǒng) ? 占 90%以上，即通常指的 DNA限制性內(nèi)切酶，它們能識(shí)別雙鏈 DNA的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的 DNA片段； ? Ⅱ 型酶分子量較小，僅需 Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識(shí)別順序一般為 46個(gè)堿基對(duì)的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序； ? Ⅱ 型內(nèi)切酶切割雙鏈 DNA產(chǎn)生 3種不同的切口： 5’端突出， 3’ 端突出和平末端。 限制性切酶以內(nèi)切的方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的 DNA片段 5’ 端帶磷酸基團(tuán)， 3’端為 OH。 ? 加入乙醇沉淀 DNA時(shí)，要把離心管蓋上蓋子倒翻搖動(dòng)幾次，注意觀察水相和乙醇之間沒有分層現(xiàn)象之后，才可以放到冰箱中去沉淀 DNA。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和 DNA的降解，培養(yǎng)時(shí)間不要超過(guò) 16小時(shí)。 ?問題一：未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決？ 原因 對(duì) 策 質(zhì)粒 DNA提取常見問題 1. 混有蛋白 2. 混有 RNA 3. 混有基因組 DNA 1. 不要使用過(guò)多菌體。檢查抗生素使用濃度是否正確。l加 2ul 6 Loading buffer于 1 %瓊脂糖電泳，電泳凝膠在凝膠成像系統(tǒng)上成像。l TE緩沖液 (含無(wú) DNase的 RNase 20 181。室溫放置 15min干燥。 12022 rpm， 4 ℃ 離心 2分鐘。 2倍體積冰預(yù)冷無(wú)水乙醇，振蕩混勻， 12022 rpm 4 ℃ 離心 5分鐘。 ， 4 ℃ 離心 5min，將上清夜轉(zhuǎn)至另一 Eppendorf管中。 4. 加 200μL溶液 II（ 新鮮配制 ），蓋緊 Eppendorf管，快速輕柔
范文總結(jié)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1