質(zhì)粒dna的提取和鑒定(參考版)
2025-05-03 06:49本頁面
【正文】 ? 可用生物軟件 Chromas查看測序結(jié)果，軟件 DNAMAN分析序列比對，觀看插入載體的外源片段是否與原基因序列一致。 瓊脂糖凝膠濃度與 DNA分子的有效分離范圍 膠濃度（％） 線性 DNA分子大?。?kb） 5～ 60 1～ 20 ～ 10 ～ 7 ～ 6 ～ 4 ～ 3 質(zhì)粒的測序鑒定 ? 為了檢查插入載體的外源片段是否與原來基因的序列一致，或發(fā)生突變的是否改變編碼區(qū)的讀框，是否發(fā)生兩種性質(zhì)差別較大的氨基酸替代，最好的方法是測序。l ； 9. 蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳； 10. 電泳條件：電壓 80v；時(shí)間 20～ 25分鐘； 11. 電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。 2. 膠床準(zhǔn)備 ① 將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有 1mm的間隙； ② 將膠床放在調(diào)整好的水平臺上； 3. 鋪膠：將冷卻致 60℃ 的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度約 5 mm； 水平電泳系統(tǒng) 4. 室溫下靜置 1小時(shí)左右，凝膠固化。l 充分混勻， 37 ℃ 水浴孵育 12h。l Bgl II 181。l 10 Buffer H 1 181。l TE 溶液，使 DNA完全溶解，短暫振蕩 5分鐘后即可酶切（或 20℃ 保存）。l ）無水乙醇，混勻后，室溫放置 2 min； 12022 rpm 離心 5 min。l預(yù)冷溶液 III，蓋緊管口，劇烈振蕩數(shù)次混勻， 冰上放置 3min； 12022 rpm離心 5 min，將上清液轉(zhuǎn)至另一 Eppendorf 管中； 6. 加入等體積（ 400 181。l 預(yù)冷的溶液 I中，劇烈振蕩，使沉淀完全分散； 4. 加 200 181。 NGAL 編碼區(qū) MCS Bgl II 一 細(xì)菌培養(yǎng)與質(zhì)粒擴(kuò)增 將微量質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，挑單克隆于 LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 載體的酶切與載體的構(gòu)建 ? 本實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒為酵母表達(dá)載體pPIC9多克隆位點(diǎn)中插入了不包含信號肽序列的 NGAL基因編碼區(qū)，該質(zhì)粒能轉(zhuǎn)化至酵母菌中，由 5′AOX1啟動 NGAL編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄后翻譯成蛋白，從而獲得大量的重組蛋白。 ? 每種酶有特異的識別核酸序列，稱為酶切位點(diǎn)，一般為回文序列。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時(shí)即可以檢測到少量的 DNA。 DNA吸收 254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在 302nm和 366
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