dna抽取和質(zhì)粒dna制備(參考版)
2025-01-20 05:49本頁(yè)面
【正文】 ? RNA可溶于 70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，可在 20 ℃ 保存。 C， 5分鐘 DEPC處理水 30ul， 混勻， 5560 176。 C ， 10分鐘 ，約 600ul 5 加入 500ul異丙醇，混勻，室溫靜置 10分鐘 12022rpm， 48 176。 1. oligo（ dT） 纖維素柱層析法 2. oligo（ dT） 纖維素柱離心法 3. oligo（ dT） 纖維素液相結(jié)合離心法 4. 磁性球珠分離法 （ 1） oligo(dT)纖維素層析柱法 （ 2） oligo(dT)纖維素液相結(jié)合離心法 （ 3）磁珠分離法 實(shí)驗(yàn)步驟 1 每 mg組織中加入 1mlTrizol試劑，高速破碎組織（使用高速組織搗碎器） 2 加入氯仿 ,輕輕顛倒混勻，室溫靜置分層。末端帶有長(zhǎng)短不同的 poly（ A） 尾巴 。 四、商品化的單相裂解試劑法分 RNA ? 目前 ， 該法已成為實(shí)驗(yàn)室最常用的總 RNA提取法 ， 其產(chǎn)量及質(zhì)量與前法相當(dāng) 。 ? 變性的 DNA與蛋白質(zhì)介于兩相的交界面 ， 可使用乙醇和異丙醇分級(jí)沉淀出來(lái) 。 四、商品化的單相裂解試劑法分 RNA ? 本法是異硫氰酸胍 酚 氯仿一步法的改進(jìn)方案 。g總 RNA， 每 106個(gè)細(xì)胞大約為 4～ 10181。 ? 本法具有簡(jiǎn)便 、 快速 、 經(jīng)濟(jì) 、 高效及提取的 RNA質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn) ， 能在 3小時(shí)內(nèi)迅速處理多個(gè)標(biāo)本 。 ? 然后在 ， 酚 /氯仿抽提細(xì)胞裂解溶液 。 ? 加入 β 疏基乙醇 、 二硫蘇糖醇 （ DTT） 等還原劑可以還原 RNase中的二硫鍵 ， 有利于RNase的變性 、 水解與滅活 。 ? RNA酶蛋白抑制劑與靶蛋白的親和力大。 DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和 RNA， 且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化 RNA的過(guò)程中不使用 DEPC。 玻璃制品和塑料制品應(yīng)浸泡在 %的 DEPC水溶液中， 37176。 O CCH2CH3 O CCH2CH3 O = = DEPC水制備： %DEPC在 37176。 (RNase inhibitor) （ 1） DEPC（ 焦碳酸二乙酯） ? 高度活化的烷基化試劑，破壞 RNA酶活性。異硫氰酸胍自身可形成氫鍵，在還原劑存在下斷裂氫鍵。 ? 蛋白質(zhì)變性劑中作用最強(qiáng)的是異硫氰酸胍和鹽酸胍，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成隨機(jī)卷曲狀態(tài)。 ? 必須在總 RNA提取分離的 最初階段 ， 盡可能地滅活胞內(nèi) RNase的活性 。 RNA的分離與純化 RNA isolation and purification 每個(gè)細(xì)胞的 RNA量約為 105 μg 80%85% rRNA 10%15% tRNA 1%5% mRNA 其他 RNA： hnRNA、 snRNA 、 snoRNA… 組織材料 起始樣品量 Total RNA提取量 blood 1ml 15~20μg lecukocytes 1 107個(gè) 約 100 μg Liver tissue 1g 約 5000 μg Culture cells 1 107個(gè) 約 100μg Renal tissue 1g 約 3000μg Skeleton tissue 1g 約 1500μg Cerebral tissue 1g 約 1500μg 一、關(guān)于 RNase酶 ? RNA易被 RNase水解 ， RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚 、 唾液 、 汗液及周圍的環(huán)境中 ? RNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵 ? RNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定 ， 去除變性劑后 ， RNase的活性又可恢復(fù) 。 方法簡(jiǎn)單實(shí)用，但是不能區(qū)分環(huán)狀或開(kāi)鏈質(zhì)粒 DNA 3 柱層析法 ? 以硅基質(zhì)作為填充層析柱的樹(shù)脂，在多鹽的條件下， DNA與硅基質(zhì)可逆性的結(jié)合進(jìn)行純化。 對(duì)于 DNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針?lè)派湫詷?biāo)記等實(shí)驗(yàn)，直接用小量或中量提取的 DNA樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實(shí)驗(yàn)要求。 超速離心將介質(zhì) CsCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過(guò)量 EB存在下，蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層； RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間，由于不同結(jié)構(gòu)的 DNA與 EB結(jié)合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開(kāi)環(huán)、閉環(huán)的 DNA區(qū)分開(kāi)。 ? CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。 由于制備的質(zhì)粒 DNA有較多污染，不能用于分子克隆中的酶學(xué)反應(yīng)，但可用于質(zhì)粒的鑒定。 本法簡(jiǎn)單快捷、成本低，提取的質(zhì)粒可用于限制性內(nèi)切酶圖譜分析。 但有一部分質(zhì)粒 DNA會(huì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失 ， 故產(chǎn)率不高 。 （三） SDS裂解法 ? 將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中 ， 用溶菌酶和 EDTA處理以破壞細(xì)胞壁 ， 再用 SDS裂解去壁細(xì)胞 ， 從而溫和地釋放質(zhì)粒到等滲液中 ， 然后酚 /氯仿抽提 ， 乙醇沉淀 、 洗滌質(zhì)粒 DNA。對(duì)于會(huì)釋放出大量糖類的菌株不適宜。 SDS ? Solution III: CH3COOH 堿裂解提取質(zhì)?？赡艽嬖诘膯?wèn)題 ? 少量純化質(zhì)粒是，多少菌液比較合適？ 2ml細(xì)菌可獲得 10~15μg質(zhì)粒 ? 加入 Solution II 后溶液應(yīng)該澄清，如出現(xiàn)渾濁可能存在的情況？ 菌體量過(guò)大 菌液與 Solution I混合不充分 ? 在熱或堿的條件下時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致什么結(jié)果？ 質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)不可逆變性 如：環(huán)狀 DNA不能被限制酶酶切 遷移速率在凝膠中是超螺旋近 2倍 Br染色較弱等 （二）煮沸裂解法（ boiling） ? 將細(xì)菌懸浮于含 TritonX100和溶菌酶
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