dna抽取和質粒dna制備(編輯修改稿)
2025-02-13 05:49 本頁面
【文章內容簡介】 plasmid extraction 質粒簡介 質粒 (plasmid)是細菌內獨立于染色體并能自我復制的小環(huán)狀 DNA分子 其大小范圍從 lkb至 200kb以上不等 。 已經在形形色色的細菌類群中發(fā)現(xiàn)質粒 . 這些質粒都是獨立于細菌染色體之外進行復 制和遺傳的輔助性遺傳單位。 Chromosome DNA genome Plasmid DNA 質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值，而質粒的分離與提取則是最常用、最基本的實驗技術． 質粒特性 1. 分子相對小 2. 含有高效的自主復制成分 3. 不相容性 (inpatibility) 4. 轉移性 5. 選擇的標記 (selective markers) 6. 限制性內切酶單一切口 質粒的結構特點 ? 分子量相對較小 ? 共價閉合分子 ? 雙鏈環(huán)狀結構 具有更強的抗切割和抗變性能力 超螺旋 DNA分子 ?線性 DNA分子 ?半開環(huán) DNA分子 Plasmid vectors 表達載體 載體含有 tac啟動子、 Lac操縱基因、 SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等 Exprssion vector 細菌收集 純化質粒 DNA 細菌培養(yǎng) 細菌裂解 質粒 DNA的提取和純化 質粒 DNA的提取和純化 一、細菌的培養(yǎng) (bacterial culture) l 先分離單個菌落，接種到含少量適當抗生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細菌的生長，質粒 DNA也在自主復制。 對于松弛型質粒，由于它的復制在一定程度上不受到宿主細胞的控制，故在細菌對數(shù)生長后期，加入氯霉素（ chloromycetin）抑制宿主蛋白質的合成和染色體 DNA的復制。質粒 DNA的復制不受影響而大量擴增 l 所以使用氯霉素的主要目的 ， 是在不減低質粒產量的前提下 ， 減少細菌的培養(yǎng)體積和細菌的數(shù)量 ． 有時質粒在細菌中的擴增狀況很差 ， 常是由于質粒攜帶外源基因或質粒分子量過大所致 。 二、細菌的收集 (bacterial collection) ? 細胞生長過程中 ， 排出大量代謝產物 ， 為了提高質粒 DNA的純度 ， 離心棄上清 ， 細菌沉淀最好用 STE或生理鹽水懸浮 ， 漂洗l2次 ， 離心管壁上的液體也應該仔細去除干凈 。 三、細菌裂解 ? 細胞的裂解方法很多 ， 如去污劑法 ， 沸水熱裂法 、 堿變性法 ， 有機溶劑法和溶菌酶法等 。 不同方法各有利弊 ， 一般要根據(jù)質粒性質 、 宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇 。 質粒提取的方法 ? 堿裂解法 (Alkaline ) ? 煮沸裂解法 ? SDS裂解法 ? 其他 質粒 DNA提取方法的選擇 l 常用的煮沸法 ， 堿法 ,SDS法均可獲得較滿意效果 ． 至于有人采用堿法提取小量細菌培養(yǎng)物的質粒 ， 用煮沸法或 SDS法進行質粒 DNA的大量分離 ， 只是各個實驗室的習慣問題 . l選擇哪種方法制備質粒 DNA， 應考慮以下因素： 1．菌株類型（ type） 2．質粒的大小 (size) 3．細菌染色體 DNA變性條件強弱的控制 (denaturation condition) 質粒 DNA的小量制備 25ml 質粒 DNA的大量制備 500ml ? 大質粒（ 15kb） 的處理方法： 采用溫和處理方法，使用蔗糖、溶菌酶、 EDTA，后再使用 SDS裂解，使 plasmid損傷減少 ? 小質粒（ 15kb） 的處理方法： 無需特殊處理，堿裂解方法等均可使用 四、細菌的裂解和質粒 DNA的提取 (bacterial and plasmid extraction) ? 在 NaOH存在的強堿性 （ ～ ） 條件下 ，用 SDS破壞細胞壁和裂解細胞 ， 并使細胞的蛋白質與 DNA發(fā)生變性 ， 釋放出質粒 DNA （一）堿裂解法 (Alkaline ) ? 細胞被裂解后 ， 細胞壁 、 膜的碎片 、 變性的蛋白質和染色體 DNA形成大的復合物 ? 當 pH調至中性 ， 質粒 DNA重新恢復天然的超螺旋 ? 在 高鹽 條件下沉淀 ， 經離心分離 ， 質粒 DNA保留在上清液中 1在 ， 線性的大分子量細菌染色體 DNA變性 ， 而共價閉環(huán) (CC)質粒 DNA仍為自然狀態(tài) 。 B 將 pH調至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體 DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結構。大部分 DNA和蛋白質在去污劑 SDS的作用下形成沉淀，而 CC質粒 DNA仍然為可溶狀態(tài)。 C、 通過離心 ， 可去除大部分細胞碎片染色體 DNA、 RNA及蛋白質 ， 質粒DNA尚在上清中 ， 再用酚 、 氯仿抽提進一步純化質粒 DNA。 堿裂解法示意圖 1~4ml培養(yǎng)細菌收集 細菌破裂溶解 染色體基因組和蛋白質變性、質粒變性 變性的細菌基因組形成網(wǎng)狀、蛋白質變性、質粒復性 Solution I Solution II Solution III 分離、純化質粒 DNA 堿裂解法提取質粒的試劑及主要成分 : (main regeants and ponents) ? Solution I: TrisHCl。 EDTA。 glucose ? Solution II: NaOH。 SDS ? Solution III: CH3COOH 堿裂解提取質?？赡艽嬖诘膯栴} ? 少量純化質粒是，多少菌液比較合適？ 2ml細菌可獲得 10~15μg質粒 ? 加入 Solution II 后溶液應該澄清，如出現(xiàn)渾濁可能存在的情況？ 菌體量過大
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