ecoli感受態(tài)細胞的制備、質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)化、提取與酶切鑒定(編輯修改稿)
2025-02-01 02:56 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 液 I: 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA ()， 25mmol/L TrisHCl ()； 溶液 II: , 1%SDS (現(xiàn)配現(xiàn)用 )； 溶液 III: 乙酸鉀溶液 (3M, pH=)( 60mL的5mol/L KAc, 冰醋酸， H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE緩沖液 : 10mmol/L， TrisHCl, 1mmol/L，EDTA， ； 5 TBE緩沖液： －硼酸， mol/L EDTA, pH ； 10 Loading buffer： 1% SDS, %溴酚蘭， 50％的甘油； 無水乙醇； 70％乙醇； 標(biāo)準分子量片段； 核酸內(nèi)切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解緩沖液 (10 buffer H)； 瓊脂糖； 溴化乙啶（ EB）染色液 (10mg/ml)。 四．操作步驟 : (一 ) 感受態(tài)細胞的制備： 從新活化的 DH5α 平板上挑取一 單菌落 ，接種于 3～ 5ml LB液體培養(yǎng)中 ， 37℃ 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期 (12h左右 )； 將該菌懸液以 1:100～ 1:50轉(zhuǎn)接于 100ml LB液體培養(yǎng)基中 ， 37℃ 振蕩擴大培養(yǎng) ， 當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后 ， 每隔 20～ 30min測一次 OD600， 至 OD600為 ～ 止培養(yǎng) ， 并轉(zhuǎn)裝到 mL離心管中； 培養(yǎng)物于冰上放置 20min； 0～ 4℃ ， 4000g離心 10min，棄去上清液，加入 1 mL冰冷的 ／ L CaCl2溶液，小心懸浮細胞 , 冰浴 20分鐘； CaCl2純度至關(guān)重要，不同廠家， 甚至同一廠家不同批號的產(chǎn)品均影響感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率 0～ 4℃ ， 4000g離心 10min， 倒凈上清培養(yǎng)液 ，再用 mL冰冷的 ／ L CaCl2溶液 輕輕懸浮 細胞 ，冰浴 20min； 0～ 4℃ ， 4000g離心 10min， 棄去上清液，加入100 181。L冰冷的 ／ L CaCl2溶液， 小心懸浮細胞 ，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細胞懸液； 制備好的感受態(tài)細胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實驗，如果在 4℃ 放置 12～ 24h，其轉(zhuǎn)化效率可以增高 4～ 6倍 ；也可加入占總體積 15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于 ，置于 70℃ 條件下，可保存半年至一年。 （二）質(zhì)粒 DNA的轉(zhuǎn)化： 每 100181。L感受態(tài)細胞懸液中加入 1181。L質(zhì)粒 DNA,輕輕搖勻，同時設(shè)置三組對照： (1)不加質(zhì)粒， (2)不加受體菌， (3)加已知具有轉(zhuǎn)化活性的質(zhì)粒 DNA， 具體操作按下表進行： *陽性對照，用已知具有轉(zhuǎn)化活性的 pGEXPDIPr質(zhì)粒 DNA進行轉(zhuǎn)化 編號 組 別 質(zhì)粒 DNA/μL TE buf / μL 1 受體菌對照 —— 1 —— 100 2 質(zhì)粒對照 1（ μg） —— 100 3 轉(zhuǎn)化組 I 1（ μg） —— —— 100
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