質粒提取和酶切分析(編輯修改稿)
2025-06-22 18:28 本頁面
【文章內容簡介】 使內切酶變性及 DNA大分子的完整。 3) 反應前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。 4) 終止酶反應可根據(jù)需要采用不同的方法： ①酶切后不需進行下一步反應，可加入含 EDTA的終止液終止反應。 ②若需進一步反應 (如連接，切割等 )，可將反應管置 65℃ 保溫 2030分鐘，以滅活酶，終止反應。 ③可用酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀。 4. 酶切實驗設計的一般思路 : 軟件檢測目的需要轉移操作的目的基因片段含有的酶切位點情況，選擇基因內部不存在的內切酶。 確定雙酶切的通用 buffer 確定內切酶的最適用量和酶切時間 進行酶切實驗 3. 實驗材料與儀器 ?質粒：重組質粒 ?BamHⅠ 核酸內切酶（ Takara） ?酶解緩沖液 (10 K buffer) ?離心機，水浴鍋 ?10ml微量移液器，無菌的 EP管 4. 實驗方法和步驟 Total ddH2O 10 Buffer BamHⅠ DNA(50ng/ml) 10ml 1ml 1ml 2) 質粒 DNA的限制性內切酶酶解 1) 質粒中 RNA的酶解 向 30ml質粒溶液中加入 10mg/mL Rnase 2ml， 37℃ 水浴酶解 。 置于 30℃ 水浴酶解 3小時 。 酶解完成后 ， 分別進行電泳分析 。 ?Sac1 412U/ml ?Xba1 820U/ml DNA限制性內切酶對基因組 DNA完全酶切的酶量和所用的時間是負相關的 如 Xba1: 50U完全酶切需要 5h, 5U完全酶切則需要 20h 堿裂解法小量制備質粒 DNA 一．實驗目的及背景 ? 細菌質粒是一類雙鏈、閉環(huán)的 DNA，大小范圍從 1kb至 200kb以上不等。各種質粒都是存在于細胞質中、獨立于細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。 ? 其復制和遺傳獨立于細菌染色體，但復制和轉錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。 質粒圖譜的閱讀 ? 復制起始位點 Ori? 即控制復制起始的位點。 原核生物 DNA分子中只有一個復制起始點。而真核生物 DNA分子有多個復制起始位點。 ? 抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如 Amp+? ， Neo ? 多克隆位點 MCS 克隆攜帶外源基因片段 ? ? P/E 啟動子 /增強子 ? Terms? 終止信號 ? 加 poly（ A）信號 ? 可以起到穩(wěn)定 mRNA作用 質粒圖譜的閱讀 質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條 DNA鏈，即質粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上 . 質粒特點 ? 質粒能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主細胞一些表型，是比病毒更簡單的原始生命。 ? 質粒通過細菌的結合作用，從雄性體轉移到雌性體， 是細菌有性繁殖的性因子 . ? １９５２年由 Lederburg正式命名為質粒。 質粒類型 ? 質粒按復制方式分為兩種類型： 松弛型質粒
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