質(zhì)粒提取和酶切分析(編輯修改稿)
2025-06-22 18:28 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 使內(nèi)切酶變性及 DNA大分子的完整。 3) 反應(yīng)前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。 4) 終止酶反應(yīng)可根據(jù)需要采用不同的方法： ①酶切后不需進(jìn)行下一步反應(yīng)，可加入含 EDTA的終止液終止反應(yīng)。 ②若需進(jìn)一步反應(yīng) (如連接，切割等 )，可將反應(yīng)管置 65℃ 保溫 2030分鐘，以滅活酶，終止反應(yīng)。 ③可用酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀。 4. 酶切實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一般思路 : 軟件檢測(cè)目的需要轉(zhuǎn)移操作的目的基因片段含有的酶切位點(diǎn)情況，選擇基因內(nèi)部不存在的內(nèi)切酶。 確定雙酶切的通用 buffer 確定內(nèi)切酶的最適用量和酶切時(shí)間 進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn) 3. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 ?質(zhì)粒：重組質(zhì)粒 ?BamHⅠ 核酸內(nèi)切酶（ Takara） ?酶解緩沖液 (10 K buffer) ?離心機(jī)，水浴鍋 ?10ml微量移液器，無(wú)菌的 EP管 4. 實(shí)驗(yàn)方法和步驟 Total ddH2O 10 Buffer BamHⅠ DNA(50ng/ml) 10ml 1ml 1ml 2) 質(zhì)粒 DNA的限制性內(nèi)切酶酶解 1) 質(zhì)粒中 RNA的酶解 向 30ml質(zhì)粒溶液中加入 10mg/mL Rnase 2ml， 37℃ 水浴酶解 。 置于 30℃ 水浴酶解 3小時(shí) 。 酶解完成后 ， 分別進(jìn)行電泳分析 。 ?Sac1 412U/ml ?Xba1 820U/ml DNA限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組 DNA完全酶切的酶量和所用的時(shí)間是負(fù)相關(guān)的 如 Xba1: 50U完全酶切需要 5h, 5U完全酶切則需要 20h 堿裂解法小量制備質(zhì)粒 DNA 一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘? ? 細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的 DNA，大小范圍從 1kb至 200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。 ? 其復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。 質(zhì)粒圖譜的閱讀 ? 復(fù)制起始位點(diǎn) Ori? 即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。 原核生物 DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而真核生物 DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。 ? 抗生素抗性基因 可以便于加以檢測(cè)，如 Amp+? ， Neo ? 多克隆位點(diǎn) MCS 克隆攜帶外源基因片段 ? ? P/E 啟動(dòng)子 /增強(qiáng)子 ? Terms? 終止信號(hào) ? 加 poly（ A）信號(hào) ? 可以起到穩(wěn)定 mRNA作用 質(zhì)粒圖譜的閱讀 質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針，那其實(shí)是代表兩條 DNA鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上 . 質(zhì)粒特點(diǎn) ? 質(zhì)粒能在細(xì)菌中垂直遺傳并且賦予宿主細(xì)胞一些表型，是比病毒更簡(jiǎn)單的原始生命。 ? 質(zhì)粒通過(guò)細(xì)菌的結(jié)合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到雌性體， 是細(xì)菌有性繁殖的性因子 . ? １９５２年由 Lederburg正式命名為質(zhì)粒。 質(zhì)粒類型 ? 質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型： 松弛型質(zhì)粒
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1