【文章內(nèi)容簡介】 取 ? 兼有蒸餾和溶液萃取的特征， 與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為萃取劑。 ? 超臨界流體 (supercritical fluid，SCF） ：超過氣液共存時的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點 —— 臨界點后的流體 。 臨界點的概念 可用臨界溫度和臨界壓力解釋： ?臨界溫度： 高于此溫度時，無論加壓多大也不能使氣體液化。 ?臨界壓力： 在臨界溫度下，液化氣體所需要的壓力。 ? ?SCF性質(zhì) 介于液體和氣體之間 ： ?1) SCF密度接近于液體，溶解度高。 ?2) SCF粘度和擴散系數(shù)接近于氣體， ? 傳質(zhì)擴散快 。 ?基本過程： ?1）在 SCF中，溶解度大的物質(zhì)溶于其中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì)分開。 ?2）降低壓力，使 SCF變?yōu)闅鈶B(tài)（密度降低），溶解物質(zhì)能力下降，萃取物與溶劑分離。 ?常用超臨界液態(tài) CO2作為萃取劑， ? 因為： ?1）液體 CO2無毒 ?2）臨界溫度（ ）接近常溫 ?3）臨界壓力（ ）較低 ?4）操作安全 ?超臨界 CO2萃取技術在生物、食品 ?等工業(yè)中的應用 ? CO2萃取部分產(chǎn)品 ? 原料名稱 產(chǎn)物名稱 原料名稱 產(chǎn)物名稱 ? 小麥胚芽 胚芽油 豆子 豆油精煉油 ? 啤酒花 啤酒花精油 茉莉花 凈油 ? 辣椒 辣椒紅色素 菊花根 除蟲菊酯 ? 當歸 精油 紫草 紫草寧 ? 銀杏葉 銀杏內(nèi)酯 花生 精煉油 （四） 反膠團萃取 ? 1. 反膠團： 又稱反膠束（ Reversed Micelles） ? 指 表面活性劑 （ 由親水的極性基團和疏水的非極性基團兩部分組成）分散在連續(xù) 有機 溶劑 中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體 。 反膠團模型 親水基團向內(nèi)聚集 （正）膠束 反膠束 形成 表面活性劑溶于水，使其濃度超過臨界膠束濃度。 表面活性劑溶于非極性溶劑，使其濃度超過臨界膠束濃度。 構(gòu)造 表面活性劑極性基團在外，非極性基團在內(nèi)，形成非極性核心。 表面活性劑非極性基團在外，極性基團在內(nèi)，形成極性核心，溶于水后，形成水池（ water pool ）。 功能 溶解非極性物質(zhì) 溶解極性物質(zhì) ? p154 2. 萃取過程 第一步： 將酶從水相中萃取到反膠束相中。 第二步： 將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相 中，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的反萃取過程。 反膠團萃取原理 3. 表面活性劑及有機溶劑 ? 反膠團萃取與溶劑萃取的不同，是在有機溶劑中加入了少量表面活性劑。 ?（ 1）表面活性劑 ? 常用： AOT(Aerosol OT)（陰離子表面活性劑，琥珀酸 2乙基己基酯磺酸鈉）。 ?特點： 易獲得，強度好；極性基團小，形成的反膠團空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子進入。 ?（ 2） 非極性有機溶劑 環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。 ?4. 優(yōu)點 ? 1）萃取率和反萃取率高。 ? 2）分離濃縮同時進行，溶劑可反復利用。 ? 3） 解決胞內(nèi)酶在非細胞環(huán)境中迅速失活問題。 ? 4）破壁功能，直接從完整細胞提取酶蛋白。 ? 5）成本低。 第二節(jié) 酶的精制 酶純化的基本原則： ①建立一個方便靈敏的分析方法； ②選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟； ③常在低溫（ 4℃ ）條件下進行純化，以避免酶的變性。 一、膜分離 借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、形狀、性質(zhì)的顆粒或分子進行分離的技術。 （一） 擴散膜分離 —— 透析 （ dialysis） 溶質(zhì)分子 Y 從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動 蛋白質(zhì)透析 1. 透析膜 商品透析膜大多制成管狀 。 材料：纖維素衍生物。 1）透析膜的預處理： 目的： 除雜質(zhì)。 2）透析袋的保存 ： 防腐劑＋冷藏。 2. 透析方法及裝置 透析袋透析簡單裝置。 A:透析夾， B:透析， C:透析示意圖 （二）加壓膜分離 根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為 ： 截留顆粒 直徑 操作壓力 應用 微濾 ~2?m 除菌 超濾 20A ~ ?m ~ 分離病毒及生物大分子 反滲透 20A ~13MPa 純水制備 微濾 (Microfiltration， MF) 一種靜態(tài)過濾，隨過濾時間延長，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞； 無流動操作滲透 液原料液超濾 (ultrafiltration， UF ) 一種動態(tài)過程，由泵提供推動力，在膜表面產(chǎn)生兩個分力：一個是垂直于膜面的方向分力，使水分子透過膜面，另一個是于膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。 超濾原理的示意圖 ?利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法。 ?超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應用。 常規(guī)過濾 (A)和超濾 (B)的示意圖 A B 圖 461 超濾濃縮裝置 反滲透 （ Reverse osmosis， RO） π半透膜圖14 3 利用反滲透膜選擇性地只能透過溶劑 (通常是水 )的性質(zhì)，對溶液施加壓力，使溶劑通過反滲透膜而從溶液中分離出來的過程。 滲透與反滲透 Reverse Osmosis (RO) Nanofiltration (NF) Ultrafiltration (UF) Microfiltration (MF) Membrane Filtration 3. 電場膜分離 （ 1）電滲析： 在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負電極。（ 2）離子交換膜電滲析： 用離子交換膜代替一般的半透膜。 應用： 脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。 二、層析法 ? 層析法也稱色譜法，是 1903年俄國植物學家 Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過裝有 CaCO3 吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。 ? 色譜起源 色譜 組分 色素 石油醚 碳酸鈣顆粒 用色彩（ chroma）和圖譜（ graphs）組成色譜一詞（ Chromatography) 。 層析法的基本原理 ? 利用混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在流動相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動而達到分離的目的。 ? mobile phase：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體 stationary phase：靜止不動的一相 層析法的分類 流動相有兩種狀態(tài)： *液體作為流動相 *氣體作為流動相 固定相也有兩種狀態(tài)： *固體吸附劑作為固定相 *以吸附在固體上的液體作為固定相 ? 按兩相所處的狀態(tài)分類： 液相層析 液 固層析 液 液層析 氣相層析 氣 固層析 氣 液層析 ? 按層析過程的機理分類： 吸附層析 ：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異。 分配層析 ：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。 離子交換層析 ：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。 凝膠層析 ：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。 按操作形式不同分類： 柱層析 ：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。 紙層析 ：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。 薄層層析 ：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。 Column Chromatography 層析柱的制備與層析操作 柱層析的設備 : 層析柱、蠕動泵（恒流泵）、紫外檢測儀、部分收集器、梯度洗脫器。 層析設備 ? 層析裝置： ? 梯度混和器 ? 蠕動泵 ? 層析柱 ? 監(jiān)測儀 ? 記錄儀 ? 收集器 記錄儀 低溫層析柜 層析操作 ?分離前： ? 1）樹脂預處理： 凝膠溶漲。離子交換纖維素需作酸堿處理。 ? 2）裝柱： 重力沉降法，要求 均勻，無氣泡。 ? 3）平衡： 層析柱使用前，須用 緩沖液 平衡至所需的 pH值和離子強度 。 層析操作 ?分離中： 上樣： 體積盡可能小。 平衡： 用緩沖液使不被吸附的雜蛋白穿過。 洗脫： 連續(xù)梯度洗脫：連續(xù)改變緩沖液的 pH或離子強度。 階梯式梯度洗脫：分段地改變緩沖液的 pH或離子強度。 等溫平衡洗脫：用平衡緩沖液直接進行擴展洗脫。 同時進行分步收集和檢測。 分離后： 再生，平衡，保存。 蛋白 質(zhì) 定量 —— 分光比色 儀 (A280)法 蛋白質(zhì)分子中的 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基 （ 主要是 色氨酸 Trp和酪氨酸 Tyr 的 共軛雙鍵 ） 對紫外光有吸收，以 色氨酸 吸收最強，最大吸收峰為 280nm。 在波 長 280nm具有吸光的 氨 基酸 分光比色 儀 裝置 圖 紫外吸收法 平衡、吸附 鹽 梯度 沖 洗 分管收集 蛋白 測 定 制圖 測 A280 （一）吸附層析 （ adsorption chromatography） 1. 原理 利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進行分離。 ?吸附作用的強弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關。 ?吸附層析的關鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇 。 ? 吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團作用。 ? 1）吸附劑的選擇： ? 根據(jù)吸附能力強弱分為： ? 弱吸附劑：蔗糖、淀粉 ? 中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等 ? 強吸附劑：氧化鋁、活性炭 吸附劑的選擇根據(jù)相似相溶原則： ?極性強的吸附劑易吸附極性強的物質(zhì) ?非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。 但為了便于解吸附，對于極性強的物質(zhì)通常選用極性弱的吸附劑進行吸附。 2）吸附劑的性質(zhì)： 活性炭： 常用的吸附介質(zhì)。 硅膠： 常用的極性吸附介質(zhì)。 羥基磷灰石 （ HA） [Ca10(PO4)6.(OH)2] : 微晶型的磷酸鈣制品， 表面有 Ca2+和 PO43兩種帶電基團； 酸性和中性蛋白質(zhì)可與 Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與 PO43結(jié)合。 吸附原理是 HA的 Ca2+與蛋白質(zhì)的負電荷基團作用。 3. 洗脫劑 要求： 粘度小，純度高， 穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要分離的成分 ,易與目標分子分離。 選擇： 具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動相。 生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。 4. 應用 分離純化生物大分子 （二）凝膠過濾層析 凝膠過濾（ gel filtration）又稱分子篩層析（ molecular sieve chromatography）、排阻層析（ exclusion chromatography） ,是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的 分子量不同 而進行分離的技術。 1. 基本原理 大分子物質(zhì)不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來； 小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長而后流出