【正文】 層析操作 ?分離前： ? 1）樹脂預處理： 凝膠溶漲。 薄層層析 ：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。 按操作形式不同分類： 柱層析 ：將固定相裝于柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。 離子交換層析 ：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。 ? mobile phase：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體 stationary phase：靜止不動的一相 層析法的分類 流動相有兩種狀態(tài)： *液體作為流動相 *氣體作為流動相 固定相也有兩種狀態(tài)： *固體吸附劑作為固定相 *以吸附在固體上的液體作為固定相 ? 按兩相所處的狀態(tài)分類： 液相層析 液 固層析 液 液層析 氣相層析 氣 固層析 氣 液層析 ? 按層析過程的機理分類： 吸附層析 ：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異。 ? 色譜起源 色譜 組分 色素 石油醚 碳酸鈣顆粒 用色彩（ chroma）和圖譜（ graphs）組成色譜一詞（ Chromatography) 。 二、層析法 ? 層析法也稱色譜法，是 1903年俄國植物學家 Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。（ 2）離子交換膜電滲析： 用離子交換膜代替一般的半透膜。 常規(guī)過濾 (A)和超濾 (B)的示意圖 A B 圖 461 超濾濃縮裝置 反滲透 （ Reverse osmosis， RO） π半透膜圖14 3 利用反滲透膜選擇性地只能透過溶劑 (通常是水 )的性質，對溶液施加壓力，使溶劑通過反滲透膜而從溶液中分離出來的過程。 超濾原理的示意圖 ?利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法。 2. 透析方法及裝置 透析袋透析簡單裝置。 1）透析膜的預處理： 目的： 除雜質。 （一） 擴散膜分離 —— 透析 （ dialysis） 溶質分子 Y 從高濃度一側通過膜向低濃度一側移動 蛋白質透析 1. 透析膜 商品透析膜大多制成管狀 。 第二節(jié) 酶的精制 酶純化的基本原則： ①建立一個方便靈敏的分析方法； ②選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟； ③常在低溫（ 4℃ ）條件下進行純化，以避免酶的變性。 ? 4）破壁功能，直接從完整細胞提取酶蛋白。 ? 2）分離濃縮同時進行，溶劑可反復利用。 ?（ 2） 非極性有機溶劑 環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。 ?（ 1）表面活性劑 ? 常用： AOT(Aerosol OT)（陰離子表面活性劑，琥珀酸 2乙基己基酯磺酸鈉）。 第二步： 將酶蛋白從反膠束轉移到第二種水相 中，實現(xiàn)對蛋白質的反萃取過程。 表面活性劑非極性基團在外，極性基團在內，形成極性核心，溶于水后，形成水池（ water pool ）。 表面活性劑溶于非極性溶劑，使其濃度超過臨界膠束濃度。 ?常用超臨界液態(tài) CO2作為萃取劑， ? 因為： ?1）液體 CO2無毒 ?2）臨界溫度（ ）接近常溫 ?3）臨界壓力（ ）較低 ?4）操作安全 ?超臨界 CO2萃取技術在生物、食品 ?等工業(yè)中的應用 ? CO2萃取部分產品 ? 原料名稱 產物名稱 原料名稱 產物名稱 ? 小麥胚芽 胚芽油 豆子 豆油精煉油 ? 啤酒花 啤酒花精油 茉莉花 凈油 ? 辣椒 辣椒紅色素 菊花根 除蟲菊酯 ? 當歸 精油 紫草 紫草寧 ? 銀杏葉 銀杏內酯 花生 精煉油 （四） 反膠團萃取 ? 1. 反膠團： 又稱反膠束（ Reversed Micelles） ? 指 表面活性劑 （ 由親水的極性基團和疏水的非極性基團兩部分組成）分散在連續(xù) 有機 溶劑 中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體 。 ?基本過程： ?1）在 SCF中，溶解度大的物質溶于其中，與不溶解或溶解度小的物質分開。 ? ?SCF性質 介于液體和氣體之間 ： ?1) SCF密度接近于液體，溶解度高。 臨界點的概念 可用臨界溫度和臨界壓力解釋： ?臨界溫度： 高于此溫度時，無論加壓多大也不能使氣體液化。 親和萃取酶實例 蛋白質 配基 胰蛋白酶 胰蛋白酶抑制劑 磷酸果糖激酶 三嗪染料 甲酸脫氫酶 三嗪染料 葡糖 6磷酸脫氫酶 三嗪染料 ?（三） 超臨界流體萃取 ? 兼有蒸餾和溶液萃取的特征， 與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為萃取劑。 ?3. 應用 ? 胞內酶的提取和精制 : ? 除去細胞碎片，并使酶得到純化。 ： 兩種不同水溶性聚合物濃度達到一定值時，體系會自然地分成互不相容的兩相，構成雙水相體系。由于形成的兩相均有很高的含水量（達 70%?90%），故稱 “ 雙水相 ” 系統(tǒng)。 ? 普通有機溶劑萃取難以進行蛋白質的分離， ? 因為 : ?1） 蛋白質親水性，不溶于有機溶劑 ?2） 蛋白質在有機相中易變性失活 故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質的提取 。 ? 在一定溫度、壓力下，溶質分布在兩個互不相溶的溶劑里，達到平衡后，溶質在兩相中的濃度比為一常數(shù)。 反萃?。?back extraction）： 完成萃取操作后， 將產物從有機相轉入水相的萃取操作。 萃取液 ： 經接觸分離后，溶質轉移到萃取劑中與 萃取劑形成的溶液 。 溶質： 料液中欲提取的物質 。 六、萃?。?extraction）分離 利用溶質在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質得到純化或濃縮的方法。 ? ⑵ pH變性 ? 等電點沉淀法是 pH變性法中的一種變體。 ?（五）選擇性變性沉淀法 ? 選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質變性沉淀而不影響所需蛋白質的方法。 ?② 沉淀效能高 ， 使用少量的 PEG即可沉淀相當 ? 多的生物大分子 。 2. 沉淀劑： 常用 聚乙二醇 （ Polyethyene glycol，簡寫 PEG ） 多用分子量為 6000～ 20220的 PEG。 （ 3）離子強度： 采用 增加蛋白質在有機溶劑中的溶解度 目的 防止蛋白質變性 （ 4）蛋白質濃度： 適當，一般為 5? 20mg/ml （三） 等電點沉淀 (isoelectric precipitation) ? ? 蛋白質在等電點時溶解度最低 ? 不同的蛋白質具有不同的等電點 ? 2. 使用方法 ? 單獨 使用 較少 （ 用于從粗酶液中除去某些等電點相距較大的雜蛋白 ） ， 多與其它方法聯(lián)合使用（ 如鹽析法 、 有機溶劑法 ） ， 因 蛋白質 在等電點時仍有一定的溶解度 。 ? ?4. 影響有機溶劑沉淀的因素 （ 1）溫度 ： 低溫（ 0℃ ）操作。 ? 1. 沉淀機理 ? 降低溶液的介電常數(shù) ? 部分地引起蛋白質脫水 ? 2. 常用有機溶劑 ? 丙酮 ?乙醇 ?甲醇，用量一般為酶液體積的 2倍左右，終濃度為 70%。某些對溫度敏感的酶，可在 0℃ ～ 4℃ 下操作 。 ?濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質溶解度下降。 ?3) pH值： 等電點處最易沉淀。 β 分級鹽析法 ： 在一定離子強度下，通過改變溶液的 pH及溫度的沉淀方法 。 Ks代表鹽析效率 ，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質溶解度降低的速度， Ks越大鹽析效果越好。 3. 鹽析曲線的制作 ? 如要分離一種新的蛋白質和酶，應先確定沉淀該物質的硫酸銨飽和度。 ? 2）冰箱中（ 4℃ ）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。不會大量增加溶液體積。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過 40％。 實際使用時，可直接查表 （各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。 配制飽和硫酸銨溶液 所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計算： S2S1 V=V0———— 1S2 式中 V,V0—— 分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積 S2,S1—— 分別為所需達到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度 b. 添加固體硫酸銨 適用于：蛋白質溶液原來體積已經很大，而要達到的鹽濃度又很高時。 不同蛋白質分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀， 逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質先后析出，稱分段鹽析。 2) 鹽析 （ salting out） ： 高濃度的中性鹽降低蛋白質的溶解度。 ?密度梯度離心 兼有以上兩種方法的特點，關鍵在于制備優(yōu)質的密度梯度溶液。 等密度梯度離心示意圖 （ a）離心前； （ b）離心后 密度梯度離心 等密度梯度離心 梯度介質 通常用蔗糖 最大的梯度密度 最小密度的沉降樣品 通常用 CsCl 最大的梯度密度 密度最大的沉降樣品 離心條件 在最前的沉降物質達到管底前停止，短時間，低速度 使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時間，高速度 分離依據(jù) 密度相近，但沉降系數(shù)不同 沉降系數(shù)相近，但密度不同 沉降速度離心和沉降平衡離心的特點 總結 ： ?等密度梯度離心 是一種測定顆粒浮力密度的靜力學方法，關鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。 特點： ?介質的密度梯度范圍包括所有待分離物質的密度。 離心時，在離心介質的密度梯度范圍內，不同密度的物質顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達到與其相同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。 密度梯度離心示意圖 （ a）離心前 （ b）離心后 Density gradient ultracentrifugation 密度梯度離心 步驟： B. 加樣 3. 等密度梯度離心 又稱 沉降平衡離心 （ sedimentation equilibrium centrifugation）。 特點： ?區(qū)帶內的液相介質密度小于樣品物質 顆粒的密度。 差速離心分離示意圖 （ a）離心前的懸浮液 （ b）～（ e）離心不同時間后顆粒的沉降情況 2．密度梯度離心 （ density gradient centrifugation） 樣品在 密度梯度介質 中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。 2）壁效應嚴重。 優(yōu)點： 操作簡單 。 （三）常用離心方法 差速離心法 沉降速度法 密度梯度離心 沉降平衡法 等密度梯度離心 1．差速離心 （ differential centrifugation） 采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法 。 角式離心機和離心頭（轉子） ? 角式離心頭要配套，低溫使用要預冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。 ? 使用超速離心機時先抽真空。 （二）離心機的種類 按離心