酶的分離和純化ppt課件-文庫(kù)吧資料
2025-01-11 20:18本頁(yè)面
【正文】 摩爾質(zhì)量 （ 分子量 ） ， R為氣體常數(shù) （ g） 洗脫：更高親和力的物質(zhì)置換；劇烈改變環(huán)境條件 親和層析原理 Affinity chromatography 二、 超離心技術(shù) 利用物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量、浮力因子等方面的差別用強(qiáng)離心力進(jìn)行分離 ? F = w2r （ F — 相對(duì)離心力 RCF； RCF以 g的倍數(shù)表示 ） ? RCF = w2r/980 w = π(轉(zhuǎn)數(shù) /分 ） / 30 ? RCF = 105 r(轉(zhuǎn)數(shù) /分 )2 ? 離心機(jī)： ? a) 桌式： 3000轉(zhuǎn) /分 紅血球 、 酵母細(xì)胞等粗沉淀物 ? b) 高速離心機(jī)： 20220 – 25000轉(zhuǎn) /分 一般實(shí)驗(yàn)使用但病毒 、 小細(xì)胞器或單個(gè)分子不能沉降 ? c) 超速離心機(jī)： 75000轉(zhuǎn) /分 分子生物學(xué)必備；能分級(jí)只有在電鏡下才能看得見(jiàn)的亞細(xì)胞器 二、電泳（ electrophoresis）技術(shù) ? 1） 原理： M =d L / E t M: 遷移率 L: 顆粒泳動(dòng)距離 t: 通電時(shí)間 E: 電勢(shì)差 ? 遷移率與下列因素有關(guān)： a） 樣品帶電狀態(tài) 、 分子形狀與大小 b） 電場(chǎng)強(qiáng)度 c） 緩沖液 pH的和離子強(qiáng)度 d） 支持介質(zhì)的阻力 、 吸附作用 ? 2） 電泳類(lèi)型： a） 紙電泳 b） 醋酸纖維薄膜電泳 c） 瓊脂糖電泳 d） 聚丙烯酰胺凝膠電泳 PAGE和 SDSPAGE ? 聚丙烯酰胺凝膠電泳： Acr+Bis； TEMED， %；過(guò)硫酸胺 ,%； ? 等電聚焦 (isoelectric focusing)：兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)作用下建立一個(gè) pH梯度分離蛋白質(zhì) ? 電泳檢測(cè)： a） 考馬斯亮蘭 （ 氨基黑 ） 染色法 ? b） 熒光染色法 c） 特異酶檢測(cè) d） 其他染色法 盤(pán)狀電泳（ A）和平板電泳（ B） 第四節(jié) 提純過(guò)程中的定量 ? 蛋白質(zhì)濃度： 1） 雙縮脲法： Cu++與肽鍵及酪氨酸殘基絡(luò)合顯色；測(cè)定濃度 ? 2） Lowry法：雙縮脲法的改進(jìn) ， Cu++與蛋白質(zhì)在堿性溶液中絡(luò)合 ， 此絡(luò)合物還原 Folin試劑 ， 測(cè)定濃度 20400μg/ml ? 3)紫外吸收法： Tyr、 Trp、 Phe在 280nm有最大光吸收 ，此方法因上述三種氨基酸含量不同測(cè)定結(jié)果有誤差 測(cè)定濃度? 4 ） Bradford 法 : 該 法 是 根 據(jù) 蛋 白 質(zhì) 與 考 馬 斯 亮 藍(lán)（ coomassi
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