酶的分離和純化ppt課件(已修改)
2025-01-17 20:18 本頁面
【正文】 第二章 酶的分離和純化 Isolation and Purification of enzyme ? 方法概括 ? 原料處理：包括組織破碎、緩沖液抽 ? 粗分級：一般采用硫銨沉淀、乙醇沉淀或其他方法 ? 細(xì)分級：一般采用離子交換層析、凝膠層析、親和層析和電泳 第一節(jié) 原料選擇及預(yù)處理 ? 動(dòng)物原料 ：動(dòng)物組織或臟器 （ 活體取出 ） 充分脫血 10℃ — 50℃ 保存 ? 植物原料 ：植物原料 磨碎 加入緩沖液抽提 ? 植物原料特點(diǎn)： 1） 纖維含量高 2） 酚酶活力高 3） 緩沖液 pH易被細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)改變 ? 微生物原料 ：菌體培養(yǎng) 做酶活 —時(shí)間曲線 確定最大酶活時(shí)間 細(xì)胞破碎 ? 微生物細(xì)胞破碎一般采用 ? 1） 化學(xué)法：堿；去垢劑；有機(jī)溶劑；酶解；冰凍復(fù)融 ? 2） 物理法：熱處理；滲透壓；減壓；聲波振蕩 ? 3） 機(jī)械法：加磨料；研磨；擠壓 ? 4） 緩沖液抽提 ? 抽提緩沖液的加入要少量多次 ， 植物酶抽提時(shí)可加5mM的 Vc 第二節(jié) 酶的粗提 ? 沉淀 ? 核酸沉淀： a） MnCl硫酸魚精蛋白、鏈霉素可使核酸沉淀，離心除掉 （ b）加入核酸酶將其降解 ? 雜蛋白沉淀：根據(jù)目的酶的特性方法各異 ? 選擇性沉淀（鹽析）：最常用的方法 ? 沉淀過程中隨時(shí)監(jiān)測蛋白濃度和酶活力 ? 討論： ? （ a） 鹽的加入速度合適 ? （ b） 蛋白質(zhì)開始沉淀處的硫銨濃度與蛋白濃度有關(guān) ? （ c） 硫銨濃度表示法；飽和度 25℃ ? （ d） 硫銨飽和溶液 pH7， 若目的酶易酸變性必須用緩沖液 ? （ e） 硫銨溶液密度較高 （ ） ， 故需較大離心力 ? 此步可除去 75%以上的雜蛋白 ， 且可使蛋白濃縮 透析與濃縮 ? 1） 透析袋處理： ? 透析袋 EDTA煮半小時(shí) 蒸餾水煮半小時(shí) 反復(fù)八次 帶橡皮手套用鑷子拿取 ? 2） 透析除鹽： 200倍于被透析物； 4小時(shí)換一次透析液；監(jiān)測電導(dǎo)值 ? Sephadex G25 除鹽：柱長 50cm；上樣小于床體積的 20% ? 3） 濃縮： a） 火棉膠 b） 聚乙二醇 （ PEG） ? c） 超濾 （ 35kg/cm2） d） 凍干 透析技術(shù)原理圖 超濾技術(shù)原理圖 第三節(jié) 酶的精制 一、層析技術(shù)（ chromatography）
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