酶工程3酶的分離純化-文庫吧資料
2025-06-01 22:00本頁面
【正文】 大于凝膠孔徑的分子不能進(jìn)入膠粒內(nèi)部而從膠粒間空隙擴(kuò)展，下移速度較快，而小于凝膠孔徑的分子進(jìn)入膠粒內(nèi)部，下移速度較慢，經(jīng)過一定時間后不同大小分子按先大后小的順序從層析柱中流出。 聚蔗糖 的商品名是 Ficoll， 它是由蔗糖和 1 氯 2,3環(huán)氧丙烷合成的高聚物 ， Mr 約 400000。 加壓 酶溶液 超濾膜 支持柵板 超濾液 超濾裝置 離心法 —— 離心是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分開的技術(shù)。 超濾膜 —— 制備超濾膜的材料多是高分子聚合物（如聚砜類，聚四氟乙烯等；目前有圓形和卷式等多種超濾膜類型；主要參數(shù)是截留分子量，耐受壓力和濾速和有效過濾面積等；主要商品型號有 Amicon Diaflo系列等。 透析袋的預(yù)處理 ：干燥的透析袋在制備過程中曾用10%甘油處理過，只要浸泡濕潤和蒸餾水洗滌即可使用；必要時可用 10mmol/L 碳酸氫鈉， 50%乙醇和10mmol/L EDTA處理后，再用蒸餾水洗滌。 透 析 (Dialysis)法： 過程 ：將酶溶液裝入透析袋中，放入蒸餾水或稀緩沖液中，小分子物質(zhì)通過透析袋進(jìn)入水或緩沖液中，而蛋白質(zhì)被截留在透析袋中； 透析袋類型 ：有兩種，再生纖維素膜透析袋和纖維素酯透析袋。 利用待分離蛋白質(zhì)與混合物中其它蛋白質(zhì)之間在性質(zhì)上的差異 ， 即能設(shè)計出一組合理的分級分離步驟 。連接在多肽主鏈上的氨基酸殘基可以是 帶正電荷的或帶負(fù)電荷的 、 極性的或非極性的 、 親水性的或疏水性的 。 能從混合物中分離和純化出一種蛋白質(zhì)是因為不同蛋白質(zhì)有著不同的物理和化學(xué)性質(zhì) 。 2. 生物體系的特性 對一些有生物活性的物質(zhì) ， 不是能夠用一般的物化性質(zhì)來表達(dá)的 ， 這就需要了解這些物質(zhì)的生物特性 ， 特別要知道影響生物特性變化的條件和這些物質(zhì)失活的因素 ， 包括溶劑 、 pH值 、 溫度等等 。 在涉及具有生物活性物質(zhì)的體系中 ， 有關(guān)這方面的數(shù)據(jù)與化工產(chǎn)品相比要少得多 ，嚴(yán)重影響了生物分離過程的有效進(jìn)行 。 選擇生物分離方法的依據(jù) 1 物理化學(xué)性質(zhì) 2 生物體系的特性 3 能用作分離和純化依據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì) 1 .物理化學(xué)性質(zhì) 分子大小 、 分子量 、 分子體積 、 極性 、偶極矩 、 熔點 、 沸點 、 汽化熱 、 離子電荷 、溶解度參數(shù) 、 折射率 、 表面張力 、 介電常數(shù) 、密度 、 粘度 、 酸堿強(qiáng)度 、 pK值 、 等電點 (pI)等等 。 干燥 —— 將固體、半固體或濃縮液中水分（或其他溶劑）除去一部分，以獲得含水量較少的固體過程。 膠過濾法 —— 利用 Sephadex G250或G50吸水膨脹，而酶蛋白被排阻在膠的外面。 蒸發(fā)法 —— 目前工業(yè)上采用較多的是薄膜蒸發(fā)法，在高度真空狀態(tài)下使酶溶液轉(zhuǎn)變?yōu)闃O薄的液膜，通過加熱而迅速汽化，經(jīng)旋風(fēng)式汽液分離器達(dá)到濃縮的目的。 脫色 —— 酶的工業(yè)生產(chǎn)中，常用的脫色劑為活性炭，活性炭通過吸附色素而脫色；活性炭用量一般為%%。 三、酶溶液的絮凝、凈化與脫色 絮凝 —— 由于發(fā)酵液黏度較大，細(xì)胞表面電荷排 斥以及多糖蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成的 水化層等給酶溶液的離心或過濾帶來困 難；因此要用絮凝劑進(jìn)行處理。 溫度的選擇 —— 一般控制在 04 0C， 如果酶 比較穩(wěn)定可以例外。 提取的主要方法： （ 1）鹽溶液提取 （ 2）酸溶液提取 （ 3）堿溶液提取 （ 4）有機(jī)溶劑提取 酶提取過程的注意事項 —— pH的選擇 —— 鹽的選擇 —— 溫度的選擇 —— 抽提液用量 —— 其它 pH的選擇 —— 首先考慮酶的穩(wěn)定性；其次應(yīng) 遠(yuǎn)離等電點；一般選擇 pH46 為宜。 （ II） 自溶 向菌體中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使細(xì)胞滲透性改變保持一定時間后可以使細(xì)胞自溶； （ III） 酶處理 用溶菌酶專一性地分解原核微生物細(xì)胞壁，使胞內(nèi)酶釋放 （ IV） 表面活性劑 膜結(jié)合的晶酶在細(xì)胞破碎后很難溶解，常借助于表面活性劑與脂蛋白形成微泡，使之溶解。 微生物胞外酶 可以用鹽析或有機(jī)溶劑沉淀等從發(fā)酵液中沉淀成酶泥 胞內(nèi)酶 要先收集菌體，經(jīng)細(xì)胞破碎后提取 動物材料 應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織等 植物材料 應(yīng)去皮等以免單寧等物質(zhì)著色污染 細(xì)胞破碎： 物理和化學(xué)兩大類方法 物理破碎： — 研磨（手磨，球磨和石磨）， — 機(jī)械搗碎（勻漿器和高速組織搗碎器等）， — 高壓法， — 爆破性減壓法， — 專用波振蕩， — 快速冷凍融化法等。 酶不可逆失活的原因和機(jī)理 蛋白質(zhì)（酶）的失活機(jī)理 蛋白質(zhì)不可逆失活的原因 蛋白酶水解 或自溶作用 表面活性劑 和去垢劑 聚合作用 氧化作用 機(jī)械力 變性劑 重金屬離子 和巰基試劑
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