酶工程3酶的分離純化-資料下載頁
2025-05-26 22:00本頁面
【正文】 膠具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，電泳顆粒通過網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙時(shí)受到摩擦力的作用，摩擦力的大小與樣品顆粒的大小呈正相關(guān)。 基本原理 聚丙烯酰胺凝膠 丙烯酰胺（ acrylamide Acr）單體（ monomer） N， N 甲叉雙丙烯酰胺（ N,N methylene bis acrylamide， Bis）交聯(lián)劑（ crosslinker） 聚合交聯(lián) 原理： 當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量 SDS和巰基乙醇 ， SDS能破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用，使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械臉?gòu)象，特別是強(qiáng)還原劑硫基乙醇的存在，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵還原，從而保證蛋白質(zhì)與 SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷的 蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物 。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于 如果加入一種試劑消除電荷、形狀等因素的影響，使電泳遷移率只取決于分子的大小，就可以用電泳技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。 凈電荷 分子的大小 形狀 等因素 （ SDSPAGE）的主要用途是 蛋白質(zhì)分子 量的測(cè)定 蛋白質(zhì)混合組分的分離 蛋白質(zhì)亞基組分的分析等 四、根據(jù)親和作用建立的純化方法 根據(jù)親和作用建立的純化方法 —— 由于酶對(duì)底物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 ,輔酶等配體具有較高的親和力，而其它雜蛋白對(duì)這些配體則沒有或有很弱的親和作用，因此，可以根據(jù)酶與雜蛋白對(duì)配體親和力的差異，很容易地將酶分離出來。 —— 目前已經(jīng)建立的方法有 親和層析法 和 親和電泳法 等。 親和層析法 —— 親和層析的核心是 親和吸附劑 ，它是由固相載體和能與目的酶專一可逆結(jié)合的配體共價(jià)結(jié)合而成的。將親和吸附劑填充層析柱，讓酶液流過層析柱，則目的酶就能迅速而選擇性地吸附在親和吸附劑上，用適當(dāng)?shù)娜芤哼M(jìn)行洗滌，除去一些非專一性的雜蛋白后，再用濃度高的或親和力更強(qiáng)的配體溶液進(jìn)行親和洗脫目的酶便可被洗脫出來。 親和層析中的配體構(gòu)成示意圖 Matrix: for ligand attachment, should be chemically and physically inert. Spacer arm: improve binding between ligand and target molecule by overing any effects of steric hindrance. Ligand: molecule that binds reversibly to a specific target molecule or group of target molecules. 親和體系的種類 體系 類 型 高特異性體系 抗原 — 單克隆抗體 荷爾蒙 — 受體蛋白 核酸 — 互補(bǔ)堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白 酶 — 底物、產(chǎn)物、抑制劑 群特異性體系 免疫球蛋白 — 蛋白 A、 蛋白 G 酶 — 輔酶 凝集素 — 糖 、 糖蛋白 、 細(xì)胞 、 細(xì)胞表面受體 酶 、 蛋白質(zhì) — 肝素 、 活性染料 、 過渡金屬離子 、 氨基酸 親和配基 (1) 酶的抑制劑 (2) 抗體 (3) 蛋白 A (4) 凝集素 (5) 輔酶和磷酸腺苷 (6) 三嗪類染料 (7) 過渡金屬離子 (8) 組氨酸 (9) 肝素 親和層析 1 親和層析 2 親和層析 3 親和層析過程示意圖 1. 用緩沖液平衡親和介質(zhì) 2. 樣品中的目標(biāo)分子被連接到親和介質(zhì)上，它們具有特異性吸附，但吸附是可逆的，可被洗脫下來。 3. 改變洗脫液可將目標(biāo)分子洗脫下來，如通過改變 pH值、離子強(qiáng)度、極性等。 親和層析過程示意圖 Equilibration adsorption of sample and elution of unbound material Wash away unbound material elute bound protein(s) reequilibration Column Volumes (cv) 親和電泳 —— 將親和配體共價(jià)偶聯(lián)于電泳凝膠上，由于親和作用，待分離的酶與配體結(jié)合后，在電泳中不再移動(dòng)，而其它雜蛋白不與配體結(jié)合，使目的酶分離出來。 五、根據(jù)穩(wěn)定性的差異建立的分 離純化方法 — 熱變性法 — 酸堿變性法 — 表面變性法 熱變性法 —— 根據(jù)目的酶與雜蛋白熱穩(wěn)定性差異，可以在較高溫度下，使雜蛋白變性沉淀，而酶則保持可溶狀態(tài)。 酸堿變性法 —— 與熱變性原理類似，目的酶與雜蛋白的酸堿穩(wěn)定性不同，可以調(diào)整不同的 pH使雜蛋白變性沉淀。 表面變性法 —— 可將酶溶液與惰性液體混合，振蕩造成表面變性；如在酶液中加入氯仿，振蕩后通常可分為 3層：上面為未變性的酶，中層為乳濁狀的變性蛋白，下層為氯仿。 作業(yè)題： 1. 名詞解釋：酶的抽提、膜分離技術(shù)、離子交換層析、凝膠層析、凝膠點(diǎn)泳、酶的結(jié)晶、酶的回收率和提純倍數(shù) 2. 酶分離純化的基本環(huán)節(jié)有哪些？ 3. 酶液制備的過程有哪些？ 4. 細(xì)胞破碎的方法有哪些？ 5. 說明有機(jī)溶劑沉淀分離法的優(yōu)缺點(diǎn)。 6. 酶的結(jié)晶方法有哪些？ 7. 分析說明酶分離純化的應(yīng)用方法（概念、原理和過程）。
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