【正文】 種結(jié)合而干擾分離，此時(shí)應(yīng)控制 pH＜ 5或 pH＞ 6，使它們帶相同電荷而減少結(jié)合，但應(yīng)注意酶的穩(wěn)定性和鹽的溶解度。從酶的穩(wěn)定性和溶解度來看，鹽析溫度應(yīng)控制在 0℃ 左右為宜。為了獲得較好的鹽析效果，還應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的含量，一般來說，蛋白質(zhì)濃度應(yīng)在 1mg/ml以上，蛋白質(zhì)濃度太低，如100ug/ml以下，不能形成沉淀。在 (200ug1mg)/m1范圍內(nèi)沉淀時(shí)間較長，回收率往往不高。 經(jīng)鹽折后，沉淀通過離心或壓濾與母液分開，收集后的沉淀再溶于一定的緩沖液心除去不溶物，酶溶液又得到一次純化。 鹽析層析法是鹽析與層析技術(shù)相結(jié)合的一種分離方法 .以某種非極性物質(zhì)（如瓊脂糖）為柱層析的支持物，在高的鹽濃度條件下可以使待純化的酶鹽析吸附，然后再梯度降低鹽濃度，從而使酶洗脫出來 ,這樣可增加或提高分辨率。 鹽析法安全、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，但比活力提高不多。 降低介電常數(shù)方法 在酶溶液中加入與水互溶的有機(jī)溶劑．可降低溶液的介電常數(shù) (Dielectric Constant)使酶分子間的靜電引力增強(qiáng)而發(fā)生沉淀 .另外，有機(jī)溶劑也可能使酶蛋白脫水而發(fā)生沉淀。當(dāng)不同的酶蛋白溶液中加入不同量的有機(jī)溶劑時(shí)，便會(huì)分別從溶液中沉淀出來。 影響有機(jī)溶劑沉淀法分離的因素較多。 溫度 因?yàn)榇蠖鄶?shù)球蛋白在有機(jī)溶劑中不穩(wěn)定，特別是在溫度較高時(shí)，更易變性失活。因此，所有操作必須在 0℃ 以下進(jìn)行，有機(jī)溶劑必須冷卻至 15～ 20℃ ，然后攪拌下緩慢加入，沉淀析出后趕快離心分離，并用預(yù)冷緩沖液溶解所得沉淀，以降低有機(jī)溶劑濃度。 世界酶學(xué)史上第 一個(gè)隨蛋白結(jié)晶便是 Sumner在刀豆脲酶抽提液中加入 32％丙酮得到的脲酶結(jié)品。其他常用的有機(jī)溶劑有乙醇、甲醇、異丙醇及二氧六環(huán)等 .有機(jī)溶劑的濃度以百分體積 (m1)比表爾。加入量依下式計(jì)算 V=Vo(S2S1)/(SS2) 式中． V為應(yīng)加入的有機(jī)溶劑體積； Vo為原有的體積； S、S S2分別為待加的、原溶液中含有的及所達(dá)到的有機(jī)溶劑百分比濃度。 大多數(shù)中性鹽能增加酶蛋白的溶解并能減少變性，常常在進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，于溶液中加入適當(dāng)?shù)闹行喳}，如 5％ 10％硫酸銨往往有助于提高分辨率。但其濃度不得越過 ，否則，沉淀不完全甚至無沉淀。還可以利用多價(jià)陽離子效應(yīng)，如 Zn2+、 Ba2+等，在高于待純化酶的等電點(diǎn)的 pH條件下，常能和蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物，降低其溶解度，提高分辨率。當(dāng)加入有機(jī)溶劑后，再加入 Zn2+或其他陽離子，能明顯提高分辨率 . 溶液 pH也有一定影響，一般在進(jìn)行有機(jī)溶劑法時(shí)，溶液 pH盡可能靠近待純化酶的 PI值。 此法分辨率較高、溶劑易除去，但易引起酶的變性失活。 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，所帶電荷則因 pH變化而變化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn) (Isolectric Point， pI)pH時(shí)，蛋白質(zhì)的靜電荷為零，相同蛋白質(zhì)分子間沒有了靜電排斥作用而趨于聚結(jié)沉淀，溶解度達(dá)到最低點(diǎn)。在等電點(diǎn)以上或以下的 pH時(shí)，由于蛋白質(zhì)分子間帶有相同的電荷而相互排斥，阻止了蛋白質(zhì)結(jié)聚成沉淀物，溶解度大 .不同蛋白質(zhì)具有不同的 pI值，利用蛋白質(zhì)在 PI時(shí)溶解度最低的原理，可以把不同的蛋白質(zhì)分開。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液的 pH調(diào)至被純化酶的等電點(diǎn) pH時(shí)，該酶蛋白絕大部分即被沉淀出來，那些等電點(diǎn)高高于或低于此 PH的蛋白質(zhì)仍保留在溶液中。經(jīng)離心分離出沉淀后再用一定的緩沖液溶解，被純化的酶蛋白仍保持其天然構(gòu)象。由于蛋白質(zhì)在其 PI時(shí)仍有一定的溶解度．沉淀不完全，因此常需要與其他方法配合使用。當(dāng)樣品中雜蛋白種類較多時(shí)，可將樣品 pH調(diào)到某一值后，不僅會(huì)使等電點(diǎn)狀態(tài)蛋出質(zhì)沉淀，也可使該種蛋白質(zhì)兩側(cè)帶相反電荷的雜蛋白形成復(fù)合物而沉淀，從而除去。 1964年后，經(jīng) Polson等人發(fā)展一類大分子量的非離子型聚合物，如聚乙二醇 (PFG)、聚乙烯亞胺 (PEI)、單寧酸、硫酸鏈霉素以及離子型表面活性劑 (SDS等 )，用來沉淀蛋內(nèi)質(zhì)的方法，它們?cè)谝欢l件下能與蛋白質(zhì)直接或間接形成絡(luò)合物，使蛋白質(zhì)析出，離心后收集沉淀，再用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ姑溉芙獬鰜?。?PEG常用到的分子量力 6,000和 4,000的 20％ (W/V)的濃度能將許多蛋白質(zhì)沉淀出來，同時(shí)，在適當(dāng) pH、溫度和蛋白質(zhì)濃度下調(diào)整 PEG濃度，還可分離酶，并用于培養(yǎng)結(jié)晶，核酸限制內(nèi)切酶 EcoRⅠ 可用 PEI分離， PEI在 KCl存在下，能和DNA及相關(guān)蛋白凝聚析出后，將 KCl濃度升至 ，EcoRⅠ 又重新溶解出來，這樣該酶得到了初步純化。 這種方法是利用一些多聚電解質(zhì)如聚丙烯酸 (PAA)、硫酸糊精及磷、砷、硅、鎢、鉬、釩等的雜多酸，能在極低濃度下選擇性地和某種酶結(jié)合而沉淀。其機(jī)理尚不清楚。如 PAA用于某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等的分離過程： PAA + 酶 → PAA酶 ↓ PAA酶 + Ca2+ → PAACa2+↓+ 酶 PAACa2+ + SO42 → CaSO4↓+ PAA PAA回收利用。 按分子所帶電荷的差異建立的分離方法有吸附交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等，分子荷正電多的物質(zhì)，與荷負(fù)電性的物質(zhì)反應(yīng)強(qiáng)烈，受負(fù)電場(chǎng)的影響較大；荷負(fù)電性多的物質(zhì)正相反。 按電荷的正負(fù)性設(shè)計(jì)的分離方法 吸附交換分離法 根據(jù)吸附機(jī)制不同，這類方法大體上可分為三種：物理吸附法、羥基磷灰石法和離子交換吸附法。都是利用樣品中不同分子和吸附劑間的吸附與解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離目的的。進(jìn)行的方式可以采用靜態(tài)方式，也可以采用柱層析的方式。操作過程包括：吸附劑平衡與活化、加樣吸附、洗滌和洗脫。 物理吸附法 物理吸附法的原理目前還不十分清楚。有關(guān)固體表面的吸附理論以郎格茂的吸附理論較為著名。他認(rèn)為，在固體內(nèi)部各個(gè)原子（或原子團(tuán)）的吸引力可以平均地分配到周圍原子或原子團(tuán)上去，從而使吸引力場(chǎng)成為飽和平衡的狀態(tài)。但在表面的各個(gè)原子或原子團(tuán)的吸引力不能得到飽和，還有一面伸向空間，能夠吸附住空間中與它鄰近的其他分子，這種化合價(jià)力的剩余力量就是吸附劑吸附力的本質(zhì)。常用來吸附酶的吸附劑有白土、活性氧化鋁、磷酸鈣膠、淀粉等。 吸附劑一般要經(jīng)過預(yù)先洗滌與活化，然后在低鹽、弱酸性或接近中性條件下加樣吸附，吸附后如被吸附的酶不能用水或吸附介子質(zhì)洗脫下來，可直接用它們洗除雜質(zhì)。再在弱堿條件下進(jìn)行洗脫 .如果酶仍洗脫不下來，可以提高離子強(qiáng)度，在上述洗脫劑中加入 5％ 10％的硫酸銨。 洗脫液體積不應(yīng)超過吸附劑的體積。洗脫方式一般采用靜態(tài)法，先加入少量的吸附劑，以吸附除去部分雜蛋白，此時(shí)允許有 5％ 10％左右的酶損失，除去這部分吸附劑后，再加入新鮮吸附劑，亦允許溶液有 10％左右的酶殘留，以免把大量雜蛋白吸附下來 .若以柱層析法進(jìn)行，由于吸附顆粒較小，流速慢，往住于 1份吸附劑中加入 35份纖維素混勻后裝柱，加樣平衡后以階梯或線性梯度洗滌和洗脫。 比如：用高嶺土吸附菠蘿蛋白酶。將八成熟的菠蘿去皮，壓榨，過濾（或離心）取上清液（此時(shí) pH約為 46)，加入 5％的高嶺土，攪拌吸附一定時(shí)間后，分離，收集吸附土，用 NaCO3調(diào) ，然后加 NaCl或硫酸銨進(jìn)行沉脫，當(dāng)洗脫液的體積達(dá)到原菠蘿汁體積的 1/5時(shí)，其洗脫率為 70％ 85％。 羥基磷灰石吸附法 羥基磷灰石是一種微晶型磷酸鈣，其吸附原理，一般認(rèn)為是，吸附劑表面的 Ca2+與蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的基團(tuán)，以及吸附劑表面的磷酸根離子與蛋白質(zhì)帶正電荷的基團(tuán)之間相互作用的結(jié)果。它的吸附容量較大，一般可達(dá) 50g/L床體積。也是低離子強(qiáng)度、中性或弱酸條件下吸附。多以柱層析的方式進(jìn)行、洗脫時(shí)應(yīng)提高離子強(qiáng)度；如以靜態(tài)方式，則需平衡吸附 。如有不可逆吸附，需用 1mol/L EDTA透析或。 離子交換色譜吸附 (IonExchange Chromatography) 法是利用離子交換劑為載體，這些裁體在某一定 pH條件下帶有一定的電荷，當(dāng)帶有相反電荷的酶分子通過載體時(shí)，由于靜電引力就會(huì)為載體吸附。由于各種蛋白質(zhì)和離子文換劉在不同的條件下具有相應(yīng)的不同的解離性狀。因此，通過選擇離子交換劑、控制交換和銑脫條件，就可以將酶和雜蛋白分離開來。 (1) 離子交換劑 一般由一高分子支持物和一功能基團(tuán)（又叫離子交換基）兩部分組成。離子交換劑據(jù)支持介質(zhì)的不同有離子交換樹脂、離子交換纖維素、離于交換凝膠等。 ① 離于交換樹脂：以聚苯乙烯及其衍生物為骨架導(dǎo)人相應(yīng)的離子交換基組成。如商品樹脂： Dowex（美國）、 70 72732（上海樹脂廠）、 101（華南制藥廠）等都屬于此類。這類離子交換劑由于網(wǎng)眼較小，生物大分子只能吸附在其表面．因此吸附容量較??；其離子交換基排列緊密．對(duì)生物大分子吸附太牢，必須用強(qiáng)烈條件洗脫，往往引起生物大分子變性；更主要是由于帶有疏水骨干，易引起變性等原因．主要用于無機(jī)化學(xué)、水的純化、抗生素及氨基酸分離提取等方面。其中，屬于弱酸或弱堿型的樹脂也可用于酶的分離，例如：用 101（弱陰性）分離葡萄糖氧化酶； AmberliteCC50（弱陽性）分離纖維素酶。 ② 離子交換纖維素 : 是目前酶分離純化工作用得極為廣泛的一種離子交換劑。它以長鏈開放性的纖維素為骨干導(dǎo)入相應(yīng)的交換基組成，具有較大的表面積，吸附容量較大，對(duì)酶吸附不牢，用溫和條件可洗脫下來而不致引起酶變性，同時(shí)應(yīng)用時(shí)其層析柱在廣泛的 pH和鹽濃度范圍不會(huì)發(fā)生體積變化，有利于層折分離。 ③ 離子交換凝膠 : 以交聯(lián)葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠等為骨干，導(dǎo)入相應(yīng)的交換基組成 .其交換容量較纖維素更大 ( ），同時(shí)具有分子篩作用，廣泛用于酶的分離工作。但易隨所用緩沖液 pH和離子強(qiáng)度的不同，其交換容量、床體積及流速都可能發(fā)生變化。 離了交換劑的功能基團(tuán)是離子交換基。它是離于交換劑表現(xiàn)功能的基礎(chǔ)，其性質(zhì)決定著離子文換劑的類型和強(qiáng)弱。帶陽電荷離子交換基的文換劑在離子交換過程中吸附陰離子，故稱陰離子交換刑；帶陰電荷交換基的交換劑可吸附陽離子，叫陽離子交換劑。另外．交換基有強(qiáng)弱之分：強(qiáng)酸型（硝酸基）、強(qiáng)堿型（季胺鹽）、中等強(qiáng)弱型（磷酸基、仲胺基、叔胺基）、弱酸型（羧基）、弱堿型（伯胺基）。 所謂強(qiáng)弱型是根據(jù)交換基在不同 pH條件下的解離狀況而定：強(qiáng)型的在廣泛 pH范圍內(nèi)完全解離；而弱型的解離程度以及相關(guān)的交換容量都因 pH的改變而顯著不同。常用的離子交換劑的種類和性質(zhì)如下表 ： 類型 形狀 解離基團(tuán) pK值 交換當(dāng)量(mmol/g) 特點(diǎn) 陰離子交換劑 氨乙基纖維素 纖維狀 氨乙基 弱堿性 DEAE纖維素 微粒狀 二乙氨基 弱堿性 纖維狀 TEAE纖維素 纖維狀 三乙氨基 10 堿性稍強(qiáng) GE纖維素 纖維狀 胍乙基 強(qiáng)堿性用于極高 pH ECTEOLA 纖維狀 三乙醇胺 +環(huán)氧氯丙烷 弱堿性 DEAESephacel 球狀 二乙氨乙基 177。 弱堿性 DEAESephadex A25 球狀 二乙氨乙基 177。 弱堿性 A50 QAESephadex A25 二乙氨乙基 2羧丙基 177。 弱堿性 A50 DEAESepharose 球狀 二乙氨基 177。 弱堿性 陽離子交換劑 CM纖維素 微粒狀 羧甲基 弱堿性 纖維狀 P纖維素 纖維狀 磷酸基 12 酸性較強(qiáng)用于低 pH SE纖維素 纖維狀 磺乙基 酸性強(qiáng)用于極低 pH CMSephadex G25 — 羧甲基 177。 弱酸性 G50 SPSephadex G25 — 磺丙基 177。 強(qiáng)酸性 G50 CMSepharose CL6B — 羧甲基 177。 弱酸性 (2)離子交換劑類型的選擇 應(yīng)考慮下列因素 : ① 可參考電泳結(jié)果 在中性或偏堿性條件下進(jìn)行 電泳，向陽極移動(dòng)餃快的物質(zhì)，在同樣條件下，可被陰離子交換劑吸附，向陰極移動(dòng)快或向陽極參動(dòng)較慢可被陽離子交換劑吸附，但也有例外。 ② 被分離酶的穩(wěn)定性 待分離酶在低于其 pI的 pH條件下穩(wěn)定，可選用陽離子交換劑；在高于其 pI的 pH條件下穩(wěn)定，可選用陰離子交換劉；在高于或低于其pI的 pH條件都穩(wěn)定的酶‘則可選用陽或陰離子交換劑。 ③ 如果待分離酶的 pI＜ 6或＞ 9 一般選用強(qiáng)型交換劑。因?yàn)槿跣偷年栯x子交換劑在 pH6以下、弱型的陰離子交換別在 pH9以上不帶電荷，失去交換能力，而強(qiáng)型的在廣泛的 pH范圍內(nèi)，都保持解離狀態(tài)。如果待分離的酶可用強(qiáng)型，又可用弱型，但酶不穩(wěn)定