【正文】 酶 轉(zhuǎn)換率 (1/s) 酶 轉(zhuǎn)換率 (1/s) 碳酸酐酶 600,000 凝乳蛋白酶 100 乙酰膽堿脂酶 25,000 DNA聚合酶 Ⅰ 5 青霉素酶 2,000 Trp合成酶 2 乳酸脫氫酶 1,000 溶菌酶 比活力 比活力 (性 ) (Specific Activity)是酶純度的量度，指單位重量的蛋白質(zhì)中所具有酶的活力單位數(shù)，一般用 IU/mg 蛋白質(zhì)來表示。 酶活力的測(cè)定方法 酶活力與底物濃度、酶濃度、 pH、溫度、激活劑、抑制劑的濃度以及緩沖液的種類和濃度都密切相關(guān)。 終止反應(yīng)法 (Stopped Method) 終止反應(yīng)法是將酶反應(yīng)按時(shí)間即刻完全停止，取出反應(yīng)物或產(chǎn)物，予以分離，再確定反應(yīng)物的消耗量，或產(chǎn)物的形成量，算出酶活性。 產(chǎn)物的測(cè)定方法可用酶法、化學(xué)法或放射化學(xué)法。通常采用偶聯(lián)法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反應(yīng)： 葡萄糖 + O2 → 葡萄糖內(nèi)脂 + H2O2 欲測(cè)定葡萄糖內(nèi)脂和 H2O2均較困難，可在該反應(yīng)中加入過氧化物酶和木酚，使發(fā)生下列反應(yīng) : 由于 4甲氧聯(lián)酚在 435nm 波長(zhǎng)處有光吸收峰，因此、只要測(cè)定 A435，就可知 4甲氧聯(lián)酚的量，可得 H2O2的量，從而可推知酶活力。一般偶聯(lián)酶量最少也應(yīng)在 5 倍以上。 酶偶聯(lián)測(cè)定法可用分開的也可用連續(xù)的反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行。 化學(xué)分析法的 優(yōu)點(diǎn) 是 ： 不需要特殊儀器 ， 一般有恒溫水浴 、滴定管、離心機(jī)及比色計(jì)或分光光度計(jì)即可進(jìn)行工作。 缺點(diǎn) 是：由于測(cè)定結(jié)果是根據(jù)間隔一定時(shí)間取樣所得，取樣過多，則總的工作量較大，取樣過少，則不能得到酶反應(yīng)過程的全貌，并且在實(shí)際操作過程中，取樣及停止時(shí)間不容易準(zhǔn)確控制，因此對(duì)于反應(yīng)較快的酶反應(yīng)，結(jié)果不夠準(zhǔn)確。所以現(xiàn)在對(duì)化學(xué)分析法必須作出新的評(píng)價(jià)。 優(yōu)點(diǎn) 是：靈敏，可直接應(yīng)用于酶活力測(cè)定，也可用于體內(nèi)酶活性測(cè)定，特別適用于低濃度的酶和底物的測(cè)定。此外，輻射淬滅會(huì)引起測(cè)定誤差，如 3H 發(fā)射的射線很弱，甚至?xí)患埼?。連續(xù)法使用方便，一個(gè)樣品可多次測(cè)定，且有利于動(dòng)力學(xué)研究，但很多酶還不能用該法測(cè)定。光譜吸收主要指分光光度和熒光法。 幾種連續(xù)法的例子 酶 反應(yīng) 觀測(cè)方法 乳酸脫氫酶 乳酸 +NAD+ → 丙酮酸 +NADH+H+ 丙酮酸 +NADH → 乳酸 +NAD+ 340nm波長(zhǎng)處有 NADH形成 340nm波長(zhǎng)處有 NADH減少 糖苷酶(Glycosidase) Methylumbelvifery + glucoside → 糖 + Methylumbeviferone 甲基傘型酮 (Methylumbelviferone) 發(fā)出熒光 內(nèi)纖維素酶 纖維素 → 低聚葡萄糖 黏度下降 己糖激酶 葡萄糖 + mgATP → 6 P葡萄糖 + ADP + H+ pH降低，用 pH計(jì) 非專一性磷脂酶 405nm波長(zhǎng)有硝基苯酚生成 ⑵ 偶聯(lián)的連續(xù)法 是將指示酶直接加到待測(cè)酶反應(yīng)系統(tǒng)中，將其產(chǎn)物直接或間接轉(zhuǎn)變成可用光譜吸收儀檢測(cè)的化合物。 如醛縮酶 (Aldolase) 催化 1,6二磷酸果糖生成 3P甘油醛和磷酸二羥丙酮的反應(yīng)，這些產(chǎn)物都無法直接測(cè)出，用磷酸丙糖異構(gòu)酶 (Triose Phosphate Isomerase) 作偶聯(lián)酶 (Coupling Enzyme)、甘油 1P脫氫酶 (Glycerol1Phosphate Dehydrogenase) 作指示酶，依據(jù) NADH 變成 NAD+ 的光譜變化來算出醛縮酶活性。因此，酶活性測(cè)定除了必須遵照所用分析化學(xué)方法的操作要求外，又有它的 —些特點(diǎn)。初速度的確定一般指：底物消耗量在 5％以內(nèi)，或產(chǎn)物形成量占總產(chǎn)物量的 15％以下時(shí)的速度。 第三，反應(yīng)必須在酶的最適條件（如最適溫度、 pH 和離子強(qiáng)度等）下進(jìn)行 。用反應(yīng)速度 (v) 對(duì)酶濃度(E) 作圖，應(yīng)得一條通過原點(diǎn)的直線，即 v 為 (E) 的線性函數(shù)。由圖可見，當(dāng)分別采用不同的酶濃度時(shí)，測(cè)得反應(yīng)量對(duì)時(shí)間的變化。再用反應(yīng)速度對(duì)酶量作圖 。 酶活性測(cè)定實(shí)例 這是一類專門清除體內(nèi)超氧陰離子的酶，催化反應(yīng)為 : O2﹣ +2H+ → H 2O2 + O2 由于 O2 目前已有根據(jù) O2﹣ 的歧化量，從而直接測(cè)定 SOD 活力的方法 。 這里只介紹以鄰苯三酚法測(cè)定酶活力為例的化學(xué)法。加入 SOD，可抑制自氧化速率，由此計(jì)算出酶活力。 (1) 超氧化物歧化酶 (SOD) 活力測(cè)定 單位體積活力 (u/ml) = {([( 樣品速率 )/] 100%)/50%} 反應(yīng)液總體積 (反應(yīng)液稀釋倍數(shù) /樣液體積 ) 總活力 = 單位體積活力 (u/ml) 原液總體積 操作：在試管中加入 50mmol/L TrisHCl緩沖液 ，于 25℃ 保溫 20min，然后加入預(yù)熱的 45mmol/L連苯三酚溶液（對(duì)照管用 10mol/L HCl代替） 10μl，迅速搖勻倒入1cm比色杯，每隔 30s 在 325nm 處測(cè)一次光吸收值，即可測(cè)定出連苯三酚的自氧化速率，一般要求自氧化速率控制在 OD/min。酶活力計(jì)算方法： 用這種方法測(cè)酶活力時(shí)，應(yīng)注意由于連苯三酚和被測(cè)樣液的加入量只有 10μl ， 在整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中可忽略不計(jì)，故反應(yīng)液總體積按 。 操作：試管中加入 5mmol/L 對(duì)硝基苯基糖苷 200ul， 200ul， 37℃ 預(yù)保溫 10min，再加入 χμl待測(cè)樣品并用水補(bǔ)足到 100ul， 37 ℃ 反應(yīng) 15min， 用 1ml終止反應(yīng) (注意空白管用水代替對(duì)硝基苯基糖苷和待測(cè)樣品 )，在 400nm 處測(cè)定 A 值，酶單位定義為在上述測(cè)定條件下每分鐘釋放 1μmol對(duì)硝基苯酚的量為 1 個(gè)單位的酶，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出酶活力。 材料預(yù)處理及破碎細(xì)胞 酶蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的分布有三種情況：一是釋放到細(xì)胞外的酶，叫胞外酶；二是游離在細(xì)胞內(nèi)的酶．叫溶酶；三是牢固與膜或細(xì)胞顆粒結(jié)合在 —起的，叫結(jié)酶，后二者合稱胞內(nèi)酶。微生物胞外酶，用鹽析，或單寧沉淀。胞內(nèi)酶需收集菌體，經(jīng)破細(xì)胞后提取，其中結(jié)酶還有個(gè)打斷酶蛋白和細(xì)胞顆粒結(jié)合的問題。 進(jìn)行預(yù)處理后，就是破碎細(xì)胞。用石英砂或氧化鋁作助磨劑來制備無細(xì)胞抽提液。球磨法，將干菌體放人球磨機(jī)，經(jīng)數(shù)小時(shí)研磨，用水或緩沖液抽提。細(xì)菌磨也是在實(shí)驗(yàn)室中使用較好的方法。 (3)高壓法 在結(jié)實(shí)的圓柱體容器內(nèi)裝上菌體與助磨劑，在 215℃下，于活塞上加壓沖擊，以破碎細(xì)胞。 (5)專用波振蕩 專用波振動(dòng)通過液體時(shí)形成局部減壓，叫空化作用，旋渦生成與消失時(shí)，產(chǎn)生很大壓力，從而使細(xì)胞破碎。 化學(xué)法 (1)滲透作用 將指數(shù)生長(zhǎng)期的菌體用緩沖液洗凈 ， 并懸于含蔗糖 、 EDTA的稀的 Tris緩沖液中，待平衡后離心，加入 MgCl2劇烈攪拌，可使某些水解酶從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。如空氣干燥，一般在 2530 ℃ 或高到 3540℃ 的氣流中吹干，然后將干菌體懸浮于 35倍的水中或緩沖液中，室溫?cái)嚢?23h抽提。 (4)溶菌酶處理 用溶菌酶專一性地分解菌體細(xì)胞壁上多糖分子的 β 1,4糖苷鍵，從而破壞細(xì)胞壁。 ⑹表面活性劑處理 膜結(jié)合酶在細(xì)胞破碎后很難溶解下來，常借助表面活性劑來解決。 ⑺其他 如當(dāng)細(xì)菌感染噬菌體后，噬菌體附著于菌體細(xì)胞壁，導(dǎo)致菌體自溶等。 抽提液的具體組成和抽提條件的選擇，取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶與其他物質(zhì)的連結(jié)。選用 pH不應(yīng)超過酶的pH穩(wěn)定范圍。也就是說，酸性蛋白宜用堿性溶液抽提；堿性蛋白宜用酸性溶液抽提。 其他 在細(xì)胞破碎以后，某些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)也受到損傷，常給抽提系統(tǒng)帶來不穩(wěn)定的因素，因此有時(shí)還要加入一些物質(zhì)。 鹽 大多數(shù)蛋白質(zhì)在低濃度的鹽溶液中有較大的溶解度。最普通的為 mol/L的磷酸緩沖液、 ；常用到的還有焦磷酸鈉和檸檬酸鈉的緩沖液 ， 有助于切斷酶和其他物質(zhì)的聯(lián)系 ； 據(jù)報(bào)道，少數(shù)情況下用水抽提亦佳，這可能與低滲破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)。如果酶比較穩(wěn)定，可以例外，如胃蛋白酶可在 37℃ 保溫抽提。有時(shí)，為了抽提效果好些需要反復(fù)抽提時(shí)，抽提溶液比例可能大些。由于發(fā)酵液濃度較大，細(xì)胞顆粒微小 （ 細(xì)菌細(xì)胞只有 1l0μm） ，相對(duì)密度只有 ，有些細(xì)菌細(xì)胞表面帶負(fù)電荷與發(fā)酵膠液流動(dòng)電位電荷相互排斥；由于細(xì)胞壁外層的多 糖 、蛋白質(zhì)等生物大分子與水結(jié)合成水化層而形成疏水強(qiáng)的穩(wěn)定顆粒，這些在生產(chǎn)上為酶溶液的離心或過濾凈化處理帶來困難，通常需要使用 絮凝劑 后才能凈化。濃縮的方法很多，如鹽析或溶劑沉淀法、超過濾法、離子交換樹脂法等，這些方法既是濃縮的方法，又是分離純化的手段；還有真空濃縮及冷凍濃縮法、蒸發(fā)法、凝膠吸水法、聚乙二醇吸水法等。大分子物質(zhì)中包括核酸、粘多糖及其他蛋白質(zhì)。根據(jù)不同材料選擇不同的試劑?？稍谔崛∫褐?％硫酸魚精蛋白、使之與核酸及相關(guān)蛋白形成復(fù)合物而沉淀，然后在 4℃ 采用 10,500r/min離心而除去 .至于粘多糖，常用醋酸鉛、乙醇、單寧酸及離子型表面活性刑等處理除去，有時(shí)也用酶除去。現(xiàn)有酶的分離純化方法都是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立的。 (2)根據(jù) 溶解度大小 分離的方法，如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。 (4)按 穩(wěn)定性差異 建立的分離方法，如選擇性熱變性法表面變性法等。 在酶的分離純化過程中 ， 每步都須做三件事 ： 第一 ， 測(cè)定酶活力 (IU/ml)；第二，測(cè)定蛋白質(zhì)含量 (mg/ml)；第三，測(cè)量體積 (ml)；然后將測(cè)得數(shù)據(jù)加以整理。 例如分離純化番麻 (Agave americana) 蛋白酶的主要步驟 為：葉片經(jīng) 30％乙醇水溶液壓榨提取，用冷丙酮制成干粉， 經(jīng) Sephadex G50柱層析和 SPSephadex C50純化，獲得結(jié)晶， 純化結(jié)果如表下表 : 結(jié)晶形成的過程是自由能降至最小的過程。 當(dāng)溶液處于過飽和狀態(tài)時(shí) ， 分子間的分散或排斥作用小于分子間的相互吸引作用 ， 便開始形成沉淀或結(jié)晶 ，由于溶液的過飽和，維持水合物的水分子相對(duì)減少而且不足，溶質(zhì)分子相互接觸機(jī)會(huì)增加而聚集，但是，當(dāng)溶液過飽和的速度過快時(shí)，溶質(zhì)分子聚集太快，便會(huì)產(chǎn)生無定形的沉淀。所以，在操作上必須 注意 ：第一，耍 調(diào)整溶液 ，使之緩慢地趨向于過飽和點(diǎn)；第二， 調(diào)整溶液的性質(zhì)和環(huán)境條件 ，使盡可能多的溶質(zhì)分子相互接觸，形成結(jié)晶。 結(jié)晶的基本原理 酶制劑通常有下列四種劑型： (1) 液體配制劑 包括稀酶液和濃縮酶液。這種酶制劑不穩(wěn)定，且成分復(fù)雜，只用于某些工業(yè)。有的加入淀粉等填充料，用于工業(yè)生產(chǎn)。用于加工或生產(chǎn)某種產(chǎn)品時(shí)，務(wù)須除去起干擾作用的雜酶，才不會(huì)影響質(zhì)量。 (3) 純配制劑 包括結(jié)晶酶，通常用作分析試劑和醫(yī)療藥物。醫(yī)療注射酶，還必須除去熱源。帶有這類物質(zhì)的制劑注射到體內(nèi)后引起體溫升高。它可用吸附、親和層析、改變分離純化等方法除去。 酶的制劑 ① 溫度 在低溫條件下 (04℃ )使用、處理和保存。 ② pH與緩沖液 pH應(yīng)在酶的 pH穩(wěn)定范圍內(nèi)，采用緩沖液保存。 ④ 氧 有些酶易于氧化而失活。 (1) 影響酶穩(wěn)定性的因素 ① 底物、抑制劑和輔酶 其 作用可能是通過降低局部的能級(jí)水平，使酶蛋白處于不穩(wěn)定狀態(tài)的扭曲部分轉(zhuǎn)入穩(wěn)定狀態(tài)。 ③ 其他如 Ca2+能保護(hù) α淀粉酶， Mn2+能穩(wěn)定溶菌酶， Cl能穩(wěn)定透明質(zhì)酸酶 ， 其 作用機(jī)制可能是防止酶蛋白肽鏈延展； 其次是表面活性劑 ，如許多酶配置于 1％的苯烷水溶液中，即使在室溫下催化活力也能維持相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間； 再次是高分子化合物 ，如血清蛋白、多元醇等，特別是甘油和蔗糖是近年來低溫保存添加劑。為了防止微生物污染酶制劑，加入一定濃度的甲苯、苯甲酸和百里醇等。這樣通過更換透析袋外液，使透析袋內(nèi)的小分子物質(zhì)降至最低，如右圖。所以它的持點(diǎn)是利用有選擇透過的多微孔膜，在液壓作用下，分離出大分子溶質(zhì)（右圖）。當(dāng)軸流通過管腔時(shí)，造成高剪切力，在截留溶質(zhì)分子的同時(shí)，將濃度降至最低限度。如下圖所示。攪拌型超濾器帶有磁力攪拌或機(jī)械振動(dòng)，借助攪拌或振動(dòng)造成高液流從而控制濃度極性，溶質(zhì)濃度一般為 5%（圖 a)；無攪拌型超濾器也有多種形式，如用惰性氣體推動(dòng)柱塞迫使溶液過濾的葉柱塞推進(jìn)式加壓超濾器（圖 b)，由于它無攪拌，沒有控制濃度極化，而只能處理小體積的溶液，溶質(zhì)濃度 1%。這是一種帶有淺道的超濾裝置。 離心機(jī)軸半徑示意圖 離心分離 在高速離心 (20,000r/min) 或超高速離心 (80,000r/min) 的力場(chǎng)下，酶及其他大分子發(fā)生沉降