蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)-在線瀏覽
2025-03-08 01:43本頁面
【正文】 列蛋白質(zhì)時(shí)的洗脫順序，為什么？分離蛋白質(zhì)的范圍是5,000400,000。 離子交換層析的固相是 離子交換體 ， 包括 離子交換樹脂 、 離子交換纖維素 、 離子交換葡聚糖 。 離子交換層析 (ion exchange chromatography) 陽離子交換基 強(qiáng)酸性，聚苯乙烯樹脂 弱酸性，羧甲基纖維素 弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂 陰離子交換基 強(qiáng)堿性，聚苯乙烯樹脂 弱堿性，二乙氨氨乙基纖維素 陽離子交換層析過程 離子交換樹脂 蛋白質(zhì) 高離子強(qiáng)度洗脫液洗 高離子強(qiáng)度洗脫液洗 加樣 平衡液洗 收集 1998年上海交大考研題 ? 有一蛋白水解物，在 pH6時(shí)，用陽離子交換柱層析，第一個(gè)被洗脫出來的氨基酸是： ? Val (pI=), Lys (pI=) ? Asp (pI=), Arg (pI=) ? Tyr (pI=) 是一種 吸附 層析 ， 依賴于 蛋白質(zhì)和它的配體（ ligand） 之間的相互作用來分離的 。 但在親和層析中 ， 配體是通過 共價(jià)鍵先與基質(zhì)結(jié)合 ， 配體可以是酶結(jié)合的一個(gè)反應(yīng)物或產(chǎn)物 ， 或是一種可以識(shí)別靶蛋白的抗體 。 特異結(jié)合在基質(zhì)上的靶蛋白最后可以用含有高濃度自由配體的溶劑洗下 。 原 理 親和層析過程 吸附本質(zhì) ：非共價(jià)連接 常用吸附劑 ：結(jié)晶磷酸鈣、硅膠等 脫附（洗脫）方式： 改變蛋白質(zhì)帶電狀態(tài)； 改變環(huán)境溶液的 pH、離子強(qiáng)度等。對(duì)分離 含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì) 尤為有效。 分配層析 ? 柱層析 ? 紙層析 ? 薄層層析 氣相色譜 (gas chromatograph, GC) ? 是利用樣品中個(gè)組分在色譜柱中的 氣相和固定相 間的 分配系數(shù)不同 達(dá)到分離的目的。 氣相色譜分類 ? GC根據(jù) 固定相 不同又可分為 氣固色譜法 (GSC)和氣液色譜法 (GLC)，其中以 GLC應(yīng)用最廣。 當(dāng)層析系統(tǒng)的流動(dòng)相為氣體如氫、氦、氮，固相為涂漬在固體顆粒表面的液體時(shí)，此層析技術(shù)稱為氣液層析或氣液色譜 氣相色譜法的特點(diǎn) 應(yīng)用范圍廣 ： 氣象色譜法可以分析氣體和易揮發(fā)的物質(zhì) 高效： 可以分析沸點(diǎn)十分相近的組分，和極為復(fù)雜的多組份混合物。 高選擇性： 是指固定相對(duì)性質(zhì)極為相似的組份，如同位素，烴類的異構(gòu)體等有較強(qiáng)的分離能力。 高靈敏度： 指用高靈敏度的檢測(cè)器可檢測(cè)出 1011－ 1013克的物質(zhì)。 高速： 一般分析一次用幾分鐘到十幾分鐘。色譜法易于自動(dòng)化．操作與處理都自動(dòng)化，速度很快。此外還有 超臨界流體色譜法 (SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動(dòng)相 （常用 CO2）， 因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時(shí)間短， 特別適用于手性化合物的拆分。這是近二十年內(nèi)發(fā)展起來的一項(xiàng) 快速、靈敏、高效 的分離技術(shù)。 原 理 混合物中各組分在 固定相 和 流動(dòng)相 之間會(huì)發(fā)生 吸附、溶解 或 其他親和作用 ，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的 遷移速度不同 得到分離 高效液相色譜的主要類型 按分離機(jī)制的不同分為 四類： ? 液液 分配色譜法（ partition chromatography） ? 液固 吸附色譜法（ adsorption chromatography） ? 離子交換 色譜法（ IEC） ? 空間排阻 色譜法（ SEC） 液固吸附色譜法 固定相： 吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度 510μm 流動(dòng)相： 有機(jī)溶劑 適用于分離分子量 2001000的組分，大多數(shù)用于 非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構(gòu)體。 極性較大組分滯留作用大，后流出。 ?固定相 ?將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面 ?化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的有機(jī)鍵合層，如C18（十八烷基硅烷）、 C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠 —— 常用 ?固定相類型 ?極性固定相： 正相色譜 ?非極性固定相： 反相色譜 液液分配色譜 正相色譜法 反相色譜法 1. 極性固定相 聚乙二醇 、 氨基與腈基鍵合相 2. 相對(duì)非極性流動(dòng)相 正已烷 、 環(huán)已烷 3. 極性調(diào)節(jié)劑 乙醇 、 四氫呋喃 、 三氯甲烷 4. 分離中等極性和極性較強(qiáng)化合物 . 酚類 、 胺類 、 羰基類及氨基酸類 5. 組分流出順序 極性小先洗出 1. 非極性固定相 C18（ 簡(jiǎn)稱 ODS） 、 C8 2. 極性流動(dòng)相 水或緩沖液 3. 極性調(diào)節(jié)劑 甲醇 、 乙腈 、 四氫呋喃 4. 分離非極性和極性較弱化合物 占整個(gè) HPLC應(yīng)用的 80%左右 5. 組分流出順序 極性大先洗出 液液分配色譜 離子交換色譜法 固定相： 離子交換樹脂，常用 苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上 羧基、磺酸基 構(gòu)成 陽離子交換樹脂 在表面未端芳環(huán)上接上 季胺基構(gòu)成 陰離子交換樹脂 流動(dòng)相： 電解質(zhì)溶液、有機(jī)弱酸或有機(jī)弱酸鹽溶液 ?分離原理 樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換而分離。 ?分析物質(zhì) 有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。它類似于分子篩，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多。 ? 常用于分離 高分子化合物 ，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。由于 HPLC分離能力強(qiáng) ，測(cè)定 靈敏度高 ， 選擇性高 ， 分析速度快 ，可在 室溫下進(jìn)行 ，故應(yīng)用范圍極廣， 無論是極性還是非極性，小分子還是大分子，熱穩(wěn)定還是不穩(wěn)定的化合物 均可用此法測(cè)定。 電 泳 ? 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。 ? pHpI 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，電泳中向正極移動(dòng) ? pHpI 蛋白質(zhì)帶正電荷，電泳中向負(fù)極移動(dòng) ? pH=pI 蛋白質(zhì)凈電荷為零，電泳中不動(dòng) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 支持物 :單體丙稀酰胺 (Acr) ? 交聯(lián)劑 :甲叉 (or亞甲 )雙丙稀酰胺 (Bis) ? 聚合 ? 光聚合 :核黃素 為催化劑 (陽光 ,日光 ) 制大孔膠 ? 化學(xué)聚合 : 過硫酸銨 (NH4)2S2O3， 縮寫為 APS為催化劑 N,N,N’,N’,四甲基乙二胺 縮寫為 TEMED是加速劑用來制小孔膠 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 凝膠網(wǎng)孔大?。? 聚合鏈長(zhǎng)度 :由 Acr濃度決定 交聯(lián)程度 :由 Acr與 Bis相對(duì)比例決定 ? Bis的濃度低，孔徑大，可在聚合前調(diào)節(jié)單體與 Bis的濃度比 ?如 : Acr
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