蛋白質(zhì)分分離純化和表征-在線(xiàn)瀏覽
2025-06-19 13:42本頁(yè)面
【正文】 原有的電荷差別 。 又由于其分子表面有許多極性基團(tuán) ， 親水性極強(qiáng) ， 易溶于水成為穩(wěn)定的親水膠體溶液 。 假若改變環(huán)境條件 ， 破壞其水化膜和雙電層 ， 蛋白質(zhì)親水膠體便失去穩(wěn)定性 ， 發(fā)生絮結(jié)沉淀現(xiàn)象 ， 這既是所謂的蛋白質(zhì)沉淀作用 。 優(yōu)點(diǎn)：不引起蛋白質(zhì)變性。 2．蛋白質(zhì)的沉淀 ② 有機(jī)溶劑沉淀法： 極性有機(jī)溶劑 （ 甲醇 ， 乙醇 ， 丙酮 ） → 脫去水化層以及降低介電常數(shù) 而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用 。 ③ 重金屬鹽沉淀法 :當(dāng)溶液 pHpI,蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷 ,易與重金屬離子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等 ) → 生成沉淀 。 當(dāng)溶液 pHpI時(shí) ,蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷→ 易與生物堿試劑 ,酸根負(fù)離子反應(yīng) → 沉淀 用途：臨床除去體液中干擾測(cè)定的蛋白質(zhì) ⑤ 加熱變性沉淀法 原因：加熱變性使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，損壞了水化層 用途：制豆腐（加熱 +少量鹽鹵） 四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 前處理：細(xì)胞破碎 粗分級(jí)分離：鹽析 、 等電點(diǎn)沉淀 、 有機(jī)溶劑沉淀等 細(xì)分級(jí)分離：層析 、 電泳 、 結(jié)晶 蛋白質(zhì)純化測(cè)總目標(biāo)：增加 純度或比活力 ? 動(dòng)物材料剔除結(jié)締組織、脂肪組織 。 ? 植物組織 (英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)木彌_液研磨或用 纖維素酶 )。 前處理 : 五、蛋白質(zhì)分離純化的一般方法 ? 根據(jù)分子量：如沉降速度法離心 ? 根據(jù)密度：沉降平衡法離心 ? 根據(jù)電荷和分子量：聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 根據(jù)分子量和分子形狀：凝膠過(guò)濾 ? 根據(jù)溶解度：硫酸銨分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀 ? 根據(jù)電荷：等電點(diǎn)沉淀 透析：利用半透膜的選擇通透性來(lái)純化象蛋白質(zhì)這樣的大分子物質(zhì)的過(guò)程叫透析。 （一）根據(jù)分子大小不同的分離純化方法 磁力攪拌器 透析液 裝有蛋白溶液的透析袋 攪拌子 透析 超濾 離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。 凝膠過(guò)濾法 ? 常用凝膠：交聯(lián)葡聚糖 、 聚丙烯酰胺凝膠 ， 瓊脂糖（ sepharose 或 BioGel A） ； ? 凝膠網(wǎng)孔大小一定 ， 只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部 ， 大分子則被排阻在外 ， 即分 級(jí)分離范圍或排阻極限 。 小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)洗脫歷程長(zhǎng) ， 后洗脫下來(lái) ， 洗脫體積大； ? 用洗脫體積同標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)的比例關(guān)系測(cè)定蛋白質(zhì)分子量； （二）利用溶解度差別的純化方法 影響蛋白質(zhì)溶解度的外部因素很多 ， 其中主要有：溶液的 pH、 離子強(qiáng)度 、 介電常數(shù)和溫度 。 1. 通過(guò)改變?nèi)芤?pH值的等電點(diǎn)沉淀法 2. 通過(guò)改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度的鹽析、鹽溶 3. 有機(jī)溶劑的分級(jí)沉淀 4. 通過(guò)改變溫度的沉淀法 在等電點(diǎn) pH條件下 ， 蛋白質(zhì)為電中性 ， 其物理性質(zhì)如導(dǎo)電性 、 溶解度 、 黏度 、 滲透壓等都表現(xiàn)為最低值 ，易發(fā)生絮結(jié)沉淀 。 等電點(diǎn)沉淀 鹽溶與鹽析 ? 鹽溶：一般在低鹽濃度的情況下 ， 蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加 ， 這種現(xiàn)象稱(chēng)為 鹽溶 ； ? 鹽析 :當(dāng)鹽濃度升高到一定程度后 ， 蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低 ， 結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出 ， 這種現(xiàn)象稱(chēng)為 鹽
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