【正文】 ?性能未知樣品的蛋白質(zhì)分離： 改變緩慢的梯度洗脫 → 若為單峰：分級洗脫 結(jié)果檢測 活性檢測 比活 沒有提高 目的蛋白與雜蛋白 并 沒有分開 比活有所提高，但總 活性回收很低 目的蛋白有 損失 或有 失活 現(xiàn)象 測定蛋白質(zhì) 一級結(jié)構(gòu) 時，可 不考慮 目的蛋白的生物 活性 結(jié)果保存 薄層層析 amp。 原理：利用 蛋白質(zhì)的電荷 和 層析載體的電荷 間的相互作用 ， 進(jìn)而達(dá)到分離純化的目的 。 ?陽離子交換劑 ：平衡離子帶正電的離子交換劑，能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用 ?陰離子交換劑： 平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑，與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用 pH值的影響 NH3 R COOH + NH3 R COO + R NH2 COO Low pH Positive charge High pH Negative charge Hydrogen gained Hydrogen lost 離子溶度影響 → 離子濃度增加 + 離子取代順序 （二）離子交換劑的基本類型 根據(jù)可供交換的離子性質(zhì)： ?陽離子交換劑 ?陰離子交換劑 按解離基團(tuán)的解離 pH值： ?強(qiáng)酸型交換劑 ?強(qiáng)堿型交換劑 ?弱酸型交換劑 ?弱堿型交換劑 配基 結(jié)構(gòu) pK 分類 簡稱 硫酸基 (sulphate) OSO3H 2 強(qiáng)酸 S 磺酸基 (sulphonate) (CH2) nSO3H 2 強(qiáng)酸 SM(n = 1) ， SE(n = 2) ， SP(n = 3) ， SB(n = 4) 磷酸基 (phosphate) OPO3H2 2和 6 中等酸性 P 羧酸基(carboxylate) (CH2) nCOOH 弱酸 CM(n = 1) 叔胺基 (tertiary amine) 2(CH2) nN+ H(C2H5)2 弱堿 DEAE(n = 2) 季胺基 (quaternary amine) 2(CH2) n2N+ ≡(R)3 9 強(qiáng)堿 Q ， QAE 離子交換劑的基質(zhì) 瓊脂糖 離子交換劑 離子交換 交聯(lián)葡聚糖 聚苯乙烯 離子交換 纖維素 離子交換纖維素 交換劑 名 稱（纖維素） 作 用 基 團(tuán) 特 點 陰離子 交換劑 二乙氨基乙基 DEAE+OC2H4N+(C2H5)2 最常用在 三乙氨基乙基 DEAE+OC2H4N+(C2H5)3 氨乙基 AE+OC2 H4NH2 胍乙基 強(qiáng)堿性、極高 pH仍有效 陽離子 交換劑 羧甲基 CM— OCH2COO— 最常用在 pH4以上 磷酸 P－ O PO2－ 用于低 pH 磺甲基 SM－ OCH2SO3－ 磺乙基 SE－ OC2H4SO3－ 強(qiáng)酸性用于極低 pH 常用： DEAE纖維素（二乙基氨基纖維素） CM纖維素（羧甲基纖維素） 優(yōu)點： ?開放性長鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，吸附容量大，通透性好，大分子可自由通過，使它的 實際交換容量要比離子交換樹脂大的多。 ?回收率高 缺點： ?交換劑膨脹 交聯(lián)葡聚糖 類 型 性 能 離子基因 反離子 總交換容量 （毫克當(dāng)量 /g） DEAEsephadexA25 弱堿性、陰離子交換劑 DEAE+ Cl— 177。 QAEsephadexA50 CM sephadex C25 弱堿性、陽離子交換劑 CM— Na+ 177。 SP sephadex C50 優(yōu)點： ?不會引起被分離物質(zhì)的變性或失活 ?非特異性吸附 ?交換容量大 ?同時具有分子篩效應(yīng) 離子交換葡聚糖的選用： 一般根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量而定 ?中等分子量（ 30000202200）一般選 A50和 C50 ?低分子量（＜ 30000）和高分子量（＞ 202200） 均宜 選用 A25和 C25。 Dowex eg. Dowex 4100 陽離子交換劑 Amberlite IRC amp。 CMToyopearl 富羥基 高親水性 兼性離子交換劑 基質(zhì)上連有 β丙氨酸 、 對氨基苯磺酸 、 精氨酸 等偶極離子 （三）基本操作 緩沖液的選擇 層析柱的選擇 洗脫流速 ↓ 加樣 洗脫 洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定 離子交換劑的清洗、再生和保存 ↓ ↓ ↓ ← 離子交換劑的處理 ↑ 離子交換劑的選擇 離子交換劑的選擇 配基的選擇 取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的 pH下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽離子交換劑；如帶負(fù)電，則選擇陰離子交換劑。 ? 基質(zhì)的選擇 價格 分辨率和穩(wěn)定性 特點 纖維素離子交換劑 較低 較低 適于初步分離和大量制備 葡聚糖離子交換劑 適中 適中 受外界影響較大，體積可能隨離子強(qiáng)度和 pH變化有較大改變，影響分辨率 瓊脂糖離子交換劑 較貴 較高 穩(wěn)定、分辨率高、吸附量大 顆粒大小 分辨率 平衡時間 流速 應(yīng)用 小顆粒 高 長 慢 需要高分辨率的分析或分離 大顆粒 低 短 快 分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離 離子交換劑的處理 酸堿浸泡 進(jìn)一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子，一般陽離子交換劑最后用堿 NaOH處理，陰離子交換劑最后用酸 HCl處理。 ?水懸浮 去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒 緩沖液的選擇 離子強(qiáng)度和 pH 保證各個待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合，而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定； 注意 平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會大大降低交換容量，影響分離效果。 層析柱的選擇 親和力相差不多而需要交換劑的體積較大 增加柱長為宜，使待分離的組分被 洗脫后再結(jié)合于交換劑上的概率增加 ，柱的直徑與高度的比以1： 20左右為宜。因為當(dāng)柱上洗脫液的離子強(qiáng)度高到足以完全取代被吸附的離子時，這些 被置換的離子則以同洗脫液等速率從柱上向下移動 ，如果 柱細(xì)長 ，即從脫附到流出之間的距離長，使脫附的離子擴(kuò)散的機(jī)會增加，結(jié)果造成分離峰過寬，降低分辨率。 上樣 樣品應(yīng)與起始緩沖液有 相同的 pH和離子強(qiáng)度 離子強(qiáng)度應(yīng)低 ，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達(dá)此目的。 上樣量要適當(dāng)，不要超過柱的負(fù)荷能力，通常上樣量為交換劑交換總量的 1％ 5％ 。 當(dāng)使用 陽離子交換劑 時，增加鹽離子濃度，則升高 pH值 ?親和洗脫 目的蛋白與加入離子發(fā)生 特異性相互作用 而被 置換 ?添加置換劑 能 置換 基質(zhì)上 所有蛋白質(zhì) 洗脫方法 階段洗脫和梯度洗脫 洗脫速度 洗脫速度通常要保持 恒定 洗脫速度慢：分辨率高，但洗脫峰寬 洗脫速度快：洗脫峰窄，但分辨率下降 洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定 監(jiān)測 用紫外檢測儀進(jìn)行，在 280nm處觀察洗脫液的光吸收 收集 用分步收集器收集，可以自動收集，也可以手動收集 鑒定 聚丙烯酰胺凝膠電泳、測定活性等 離子交換劑的清洗、再生和保存 清洗 ?可溶于堿的污染物 mol/L NaOH洗滌 MilliQ純化的蒸餾水洗滌 結(jié)合緩沖液洗滌 可以除去諸如脂類、蛋白質(zhì)和核酸這類的污染物。 → → 清洗 ?金屬污染物 EDTA飽和的 10 mmol/L HCl（即 pH=2）處理柱子 ?沉淀物雜質(zhì) 去污劑、尿素和鹽酸胍，可將柱子在 6 mol/L 的尿素中平衡和溫育，然后用去離子水和緩沖液洗滌。 酸堿交替浸泡：陽離子型交換劑最后用NaOH處理，陰離子型交換劑最后用 HCl處理。 C下 保存。 優(yōu)點： 凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，溫度范圍廣，不需要有機(jī)溶劑，分離效果好 缺點： 樣品被不斷稀釋，上樣量不能太大，否則分辨率變差 （一）原理 凝膠是一種 不帶電的具有三維空間的 多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，每個顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致， 小分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔 ，而 大分子則排阻于顆粒之外 。 Kd＝ (VeVo)／ Vi ?Ve 洗脫體積 ?Vo 外水體積 ?Vi 內(nèi)水體積 Ve=Vo 該成分的分子全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中，因而 洗脫速度最快 。 Ve＝ Vi+Vo 該成分不被排阻而可完成進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部 , 因而 洗脫速度最慢 。 Kd值介于 0l之間， 物質(zhì)的洗脫速度隨其 Kd值的 增加而降低。 洗脫行為可以有三種可能的情況 : 凝膠 Kd＝ 0 Kd=l 0Kd l ﹡ Kd＝ (VeVo)／ Vi 影響分離效果的因素 流速 加樣體積 樣品濃度 離子強(qiáng)度 ① 流速 ?影響洗脫液流速的因素 ?洗脫液加在柱上的 壓力 為保持層析過程中恒定的壓力，可使用恒壓瓶。脫鹽除雜 適當(dāng)提高樣品濃度 分級分離 amp。 23 700 700 3 1 9810(100) Sephadex G15 40120 177。 46 10005000 1005000 6 2 9810(100) Sephadex G50 粗 中粗 細(xì) 超細(xì) 100300 50150 2080 1040 177。 1215 300070000 100050000 24 3 4905(50) Sephdex G100 中粗 超細(xì) 40120 1040 10177。 2030 5000400000 1000150000 72 5 1472(15) Sephadex G200 中粗 超細(xì) 40120 1040 20177。 BioGel A 系列的產(chǎn)品有不同的顆粒度，有粗、中和細(xì)三檔，它們的顆粒度分別為 l50μm～ 300 μm，80μm～ 150μm和 40μm～ 80μm 。 先制成丙烯基的衍生物，然后再用 N， N’甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)，得到商品化的凝膠， 產(chǎn)物也是固體粉末，用前先溶漲。 多孔硅膠 ?優(yōu)點： 物理化學(xué) 穩(wěn)定性高 ， 耐熱耐壓 ，使用 壽命長 ?缺點： 柱效較低 、表面具有離子性，對蛋白質(zhì)有 吸附性 、不能在強(qiáng)堿性環(huán)境中使用 剛性親水性填料，具有一定直徑的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球狀顆粒 （三）基本操作 凝膠的選擇 凝膠柱的制備 上樣 洗脫 凝膠柱的重復(fù)使用與保存 凝膠的選擇 分組分離 根據(jù)樣品中的大分子和小分子 分配系數(shù)上的顯著差異 ，將其分開。 分級分離 將樣品中一些 分子量比較近似 的物質(zhì)進(jìn)行分離。 ?柱 L/D值的選擇 裝柱前，凝膠基質(zhì)用蒸餾水或洗脫液 充分溶脹。 上樣 分組分離 加樣體積約為凝膠柱床體積的 10％～ 25％ 分級分離 加樣體積約為凝膠柱床體積的 1％～ 5％ 洗脫 水 分離 不帶電荷 的中性物質(zhì) 電解質(zhì)溶液 （酸、堿、鹽的溶液 ） 分離 帶電基團(tuán) 的樣品 水與有機(jī)溶劑的混合液（ 水 甲醇、水 乙醇、 水 丙酮） 用于 吸附較強(qiáng) 的組分