蛋白質(zhì)的分離純化剖析-在線瀏覽
2024-11-04 05:30本頁面
【正文】 .5〕或0.1mol/L TrisHCl〔pH7.58.0〕緩沖液作提取液。og249。,第十頁，共六十一頁。)純化,從細(xì)胞中提取得到的蛋白質(zhì)往往是不純的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步別離(fēnl237。,第十一頁，共六十一頁。)純化,蛋白質(zhì)別離(fēnl237。 性質(zhì) 方法 分子大小 透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾 溶解度 等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀 電荷 電泳、離子交換層析 吸附性質(zhì) 吸附層析〔羥基磷灰石層析、疏水作用層析〕 對(duì)配體分子 親和層析 的生物親和力,第十二頁，共六十一頁。nb225。nb225。nb225。,粗分級(jí)別離,第十三頁，共六十一頁。n xī),向蛋白質(zhì)溶液中參加大量的中性鹽[〔NH4)2SO4，Na2SO4]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。zǐ)與水分子作用，使水的活度降低，原來溶液中大局部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子(l237。同時(shí)鹽離子(l237。,第十四頁，共六十一頁。i)、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。qīng),球蛋白,清蛋白(d224。i),(NH4)2SO4,50%飽和度,100%飽和,析出,析出,分段鹽析,第十五頁，共六十一頁。ndi224。在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小。 t243。 t243。,第十六頁，共六十一頁。n)、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。 是極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，而使蛋白質(zhì)分子沉淀。,室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。xiān)將有機(jī)溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將其逐漸參加蛋白質(zhì)溶液中，防止有機(jī)溶劑局部濃度過高，那么在很大程度上解決變性問題。,第十八頁，共六十一頁。進(jìn)一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。 常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。jīng)也是蛋白質(zhì)別離純化的方法之一，制備的結(jié)晶(ji233。,第十九頁，共六十一頁。l236。ch233。 總活力=活力單位/ml酶液總體積〔ml〕 比活力=總活力單位數(shù)/總蛋白〔氮〕mg 純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力 回收率〔產(chǎn)率〕=〔每次總活力/第一次總活力〕100%,第二十頁，共六十一頁。nd249。nd236。 蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定通常采用的方法有：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉降分析法、免疫化學(xué)法、N末端氨基酸分析法等。同樣純的蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中，應(yīng)以單一的沉降速度移動(dòng)。,第二十一頁，共六十一頁。特征：有一個(gè)固定相和一個(gè)流動(dòng)相。 根據(jù)兩相的狀態(tài)，層析法可分為：氣相層析和液相層析；按層析原理可分為：吸附(xīf249。按操作形式分為：柱層析、薄層層析、紙層析等。,第二十三頁，共六十一頁。zh236。質(zhì)量分配系數(shù)：D=kVs / Vm , Vs , Vm 為固定相和流動(dòng)相的體積。nɡ xī)的一般原理,如果柱頂參加32mg樣品(y224。ngpǐn)的質(zhì)量分配系數(shù)D為1，即樣品在兩相中是等量分配。樣品集中在中間。,第二十四頁，共六十一頁。 離子交換劑是通過化學(xué)反響將解離基團(tuán)引入到惰性支持物上形成的。 陰離子交換劑: 解離基團(tuán)帶正電, 結(jié)合陰離。當(dāng)pH〉pI，分子帶負(fù)電，可結(jié)合陰離子交換劑；當(dāng)pHpI，分子帶正電，可結(jié)合陽離子交換劑。 zǐ jiāo hu224。,帶電蛋白質(zhì)分子與交換劑的結(jié)合是可逆的。所以用一定(yīd236。ng)pH 的緩沖液就可把蛋白質(zhì)從離子交換劑上洗脫下來。,第二十六頁，共六十一頁。 zǐ jiāo hu224。i)陽離子交換劑和陰離子交換劑。i)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、弱酸、弱堿幾種類型的離子交換劑。弱酸型交換劑在低于pH弱堿型交換劑在高于pH9就難于解離，因而失去交換能力。,第二十七頁，共六十一頁。 zǐ jiāo hu224。,可用來作為交換劑支持物的物質(zhì)種類較多。zhī)的支持物是聚苯乙烯類。有三大類：纖維素、葡聚糖凝膠(sephadex)、瓊脂糖凝膠(sepharose)和合成凝膠(Trisacryl和Fractogel)。 zǐ jiāo hu224。具有松散的親水性網(wǎng)絡(luò)，較大的外表積，吸
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