【正文】 , emerging out of the bottom (eluting洗脫 ) first. ? The smaller molecules move more slowly through the column and elute later. 層析柱的洗脫體積與分子量的關(guān)系： Ve=K1K2lgM 凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量 ? SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定 相對(duì)分子質(zhì)量 SDS， 有效變性劑 ， 帶負(fù)電荷 巰基乙醇 ， 打開(kāi)二硫鍵 蛋白質(zhì)亞基在電場(chǎng)中的行為只與分子大小有關(guān) 。 Protein colloid character and deposition ?膠體系統(tǒng)的穩(wěn)定條件： ? 1 分散相質(zhì)點(diǎn)的大小 ? 2 分散相質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷 ? 3 分散相質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層 + + + ? 每克蛋白質(zhì)分子能結(jié)合 。 Protein colloid character and deposition The hydrophobic and hydrophilic parts on the surface of protein Protein colloid character and deposition ? 蛋白質(zhì)的沉淀 ? 沉淀蛋白質(zhì)的方法 ： ? 1） 鹽析法 ? 鹽析一般不引起蛋白質(zhì)的變性 ? 2） 有機(jī)溶劑沉淀法 脫去水化層及降低介電常數(shù) (酒精 ， 丙酮 ) ? 3） 重金屬鹽沉淀法 生成不溶性的復(fù)合物 ? 4） 生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀法 單寧酸 ， 三氯醋酸 ， 磺基水楊酸和硝酸 ? 5） 加熱變性沉淀法 ? 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 ?Principles of Protein purification ? 蛋白質(zhì)分離純化的程序包括： ? 1） 前處理 ? 2） 粗分級(jí)分離 ? 3） 細(xì)分級(jí)分離 ? 4） 結(jié)晶 ? 蛋白質(zhì)的分離純化方法 ?Methods of Protein Purification ? 根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中性質(zhì)的分離純化方法： ? 1）分子大小 ? 2）溶解度 ? 3）電荷 ? 4）吸附性質(zhì) ? 5）對(duì)配體分子的生物學(xué)親和力 ? 根據(jù)分子大小不同的純化方法 ? 透析和超過(guò)濾 ? 常用的半透膜是玻璃紙或稱(chēng)賽璐玢紙 。 Methods of Protein Purification Methods of Protein Purification 凝膠過(guò)濾 gel filtration chromatography 19031906， M. Tswett 將葉綠素的石油醚溶液通過(guò)CaCO3管柱 ， 并繼續(xù)以石油醚淋洗 ， 由于 CaCO3對(duì)葉綠素中各種色素的吸附能力不同 ， 色素被逐漸分離 ， 在管柱中出現(xiàn)了不同顏色的譜帶 ，所以稱(chēng)色譜圖 ?？偟恼f(shuō)來(lái)，長(zhǎng)柱分辨率高。 Column 蛋白質(zhì)的分離純化方法 ?凝膠過(guò)濾的術(shù)語(yǔ) : Vt 凝膠柱床的總（床）體積 Ve 洗脫體積 V0 孔隙體積，外水體積 Vi 內(nèi)水體積 Vm 凝膠基質(zhì)體積 Vt = Vi +V0 + Vm 蛋白質(zhì)的分離純化方法 Gel Filtration Chromatography ? 利用溶解度差別的純化方法 ? 等電點(diǎn)沉淀和 pH控制 蛋白質(zhì)的分離純化方法 利用溶解度差別的純化方法 ? 蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析 ? 鹽溶：少量鹽促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解的現(xiàn)象 ? 鹽析：大量鹽使得蛋白質(zhì)沉淀的現(xiàn)象 ? 鹽析作用 ? ?大量中性鹽的加入使水的活度降低，原來(lái)溶液中的大部分甚至全部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水 ? ?那些被迫與蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)接觸并掩蓋它們的水分子成為下一步最自由地可利用的水分子，因此被移去以溶劑化鹽離子，留下暴露出來(lái)的疏水基團(tuán) ? ?隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)疏水表面進(jìn)一步暴露，由于疏水作用蛋白質(zhì)聚集而沉淀 ? ?最先聚集的蛋白質(zhì)是表面上疏水殘基最多的蛋白質(zhì)。 室溫下 ，有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)沉淀 ， 而且伴隨著變性 。 ? 有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一是改變了介質(zhì)的介電常數(shù) 。 蛋白質(zhì)的分離純化方法 利用溶解度差別的純化方法 ? 溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響 ? 在一定溫度范圍內(nèi) ， 約 040 ℃ 之間 ， 大部分球狀蛋白的溶解度隨溫度升高而增加 。 蛋白質(zhì)的分離純化方法 利用溶解度差別的純化方法 脲或鹽酸胍的變性作用 ? 根據(jù)電荷不同的純化方法 ? 電泳 Electrophoresis ? 在外電場(chǎng)作用下 ， 帶電顆粒 ， 如不處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)分子 ， 將向著與其電性相反的電極移動(dòng) ， 這種現(xiàn)象稱(chēng)為電泳 蛋白質(zhì)的分離純化方法 Electrophoresis ? 區(qū)帶電泳 (zone electrophoresis)可分四類(lèi)： ? a 濾紙電泳和薄膜電泳； ? b 粉末電泳； ? c 細(xì)絲電泳； ? d 凝膠電泳 ， 適于分離蛋白質(zhì)和多核苷酸 、 核 酸 。 ? 電源提供直流電，在電泳槽中產(chǎn)生電場(chǎng)，驅(qū)動(dòng)帶電分子的遷移。 ? 低濃度的凝膠具有較大的孔徑 ， 如 34％ 的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)蛋白質(zhì)沒(méi)有明顯的阻礙作用 ， 可用于等電聚焦或作為 PAGE電泳的濃縮膠 ， 也可以用于分離 DNA。 SDSPAGE原理 蛋白質(zhì)的分離純化方法 SDSPAGE ? In sodium dodecyl sulfate (SDS)PAGE, the proteins are denatured and coated with an overall negative charge (due to bound SDS) and thus the basis for their separation is only their mass SDSPAGE ? The protein mixture is first treated with a reducing agent such as 2mercaptoethanol（ 巰基乙醇） or dithiothreitol（二硫叔糖醇） to break all the disulfide bonds. ? The strong anionic detergent SDS is then added which disrupts nearly all the noncovalent interactions in the protein, unfolding the polypeptide chain. SDSPAGE ? Approximately one molecule of SDS binds via its hydrophobic alkyl（烷基） chain to the polypeptide backbone for every two amino acid residues, which gives the denatured protein a large negative charge that is proportional(成比例 的 ) to its mass 蛋白質(zhì)的分離純化方法 ? 毛細(xì)管電泳 Capillary Electrophoresis ? 電泳是在微內(nèi)徑管 （ 一般為 50um內(nèi)徑和 300um外徑 ） 內(nèi)進(jìn)行的 . ? 一般管長(zhǎng) 50—100 cm， 電壓 10—50 kV， 時(shí)間10—30 min。由于電滲流很強(qiáng)，其速度一般比樣品的電泳速度大，因此所有的正、負(fù)離子和中性分子都被推向負(fù)極。 ? 蛋白