【正文】 移動時 ， 凈離心力與摩擦力的關(guān)系： ? nFc Fb= Ff ? n dx/dt mp(1υρ) ? ─── = ───── ? ω 2χ f ? ? dx/dt ? s= ───── ? ω2χ ? 單位離心場的沉積速度是個定值 ， 稱為 沉降系數(shù) （ sedimentation coefficient)或 沉降常數(shù) 。 ? 沉降分析法測定相對分子質(zhì)量 ? 蛋白質(zhì)溶液在電場中受到 強(qiáng)大的離心力 作用時 ， 如果蛋白質(zhì)的密度大于溶液的密度 ， 蛋白質(zhì)分子就會沉降 。 ? 在濃度不大時 ， 滲透壓與溶質(zhì)的相對分子量的關(guān)系為： ? π= RT(c/Mr + K c2 ) ? Mr = RT/ limπ/c ? c→ 0 滲透壓法測定相對分子質(zhì)量 ? 蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和擴(kuò)散系數(shù) ? 擴(kuò)散 （ diffusion） ? dm/dt =DA dc/dx ? D 擴(kuò)散系數(shù) ， A 擴(kuò)散面積 ? 擴(kuò)散系數(shù)隨 Mr的增加而降低 。 這時的靜水壓力就是溶液在平衡濃度時的 滲透壓（ osmotic pressure)。 ?Protein size and shape 滲透壓法測定相對分子質(zhì)量 滲透與滲透壓 ?滲透壓法測定相對分子質(zhì)量 ? 溶劑分子由純?nèi)軇?（ 或稀溶液 ） 向溶液 （ 或濃溶液 ） 單方向凈移動現(xiàn)象稱為 滲透 (osmosis)。 ? 沒有其他鹽類干擾時，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的 pH稱為 等離子點(diǎn) (isoionic point)。 + + + + + + + + － － － － － － － － + + + + + + + + － － － － － － － － 帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體） 等點(diǎn)電時的蛋白質(zhì)（親水膠體） 帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（親水膠體） 脫水 脫水 脫水 帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體） 帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體） 不穩(wěn)定蛋白顆粒 （沉淀） 蛋白質(zhì)膠體顆粒沉淀 堿 酸 堿 堿 酸 酸 沉淀技術(shù) Ionization of protein ? 蛋白質(zhì)的滴定曲線形狀和等電點(diǎn)，在有中性鹽存在下可以發(fā)生明顯的變化。第 7章 蛋白質(zhì)的分離、純化和表征 Protein Separation, Purification and Characterization 因材施法，有的放矢 Protein Purification and Characterization 對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行的各種研究 ， 要建立在對蛋白質(zhì)分子本身的性質(zhì) （ 特別是區(qū)別于其它生物與化學(xué)分子的獨(dú)特的性質(zhì) ） 和各種實(shí)驗(yàn)手段的原理和適用性深入了解的基礎(chǔ)上 。 蛋白質(zhì) 大分子 半透膜 小分子 透析袋外 小分子 透析袋內(nèi) Protein Purification and Characterization ?分離和純化蛋白質(zhì)的 各種 方法主要是利用蛋白質(zhì)之間各種特性的差異，包括： ?分子的大小和形狀 ?酸堿性質(zhì) ?溶解度 ?吸附性質(zhì) ?對配體分子的特異生物學(xué)親和力 Protein Purification and Characterization ? The aim of protein purification is to isolate one particular protein from all the others in the starting material, exploits利用 : ?Solubility ?Size ? Charge ?Hydrophobicity or/and specific binding affinity of the protein of interest Protein Purification and Characterization ?７ .1 蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) ? Ionization of protein ? 對某一種蛋白質(zhì)來說，在某一 pH，它所帶的正電荷和負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一 pH稱為蛋白質(zhì)的 等電點(diǎn) (isoelectric point, pI)。 ? 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在一定程度上決定于介質(zhì)中離子的組成。 acid excess positive charge Cation exchanger isoelectric point balanced positive and negative charge alkaline excess negative charge Anion exchanger 3 10 pH _ + Overall charge on protein The overall charge on a protein depends on pH Ionization of protein ? 蛋白質(zhì)分子的大小與形狀 ? Protein size and shape ? 根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量 鐵的原子量 ? 鐵的百分含量 =─────── 100 最低相對分子質(zhì)量 鐵的原子量 ? 最低相對分子質(zhì)量 =─────── 100 鐵的百分含量 例如，肌紅蛋白相對分子質(zhì)量 =─── 100 =16700 用其他物理化學(xué)法法測得的 肌紅蛋白 Mr與此極為接近，可 見肌紅蛋白分子中只含一個 鐵原子。 ? 滲透的結(jié)果 ， 溶液內(nèi)的體積增加 ， 液面升高 ，直至達(dá)到一定的靜水壓力時維持平衡 。 ? 滲透壓 是單位體積內(nèi)溶質(zhì) 質(zhì)點(diǎn)數(shù)的函數(shù) ， 而與溶質(zhì)的性質(zhì)和形狀無關(guān) 。 ? 但擴(kuò)散系數(shù)對 Mr的變化并不敏感 ， 一般不單獨(dú)用來確定 Mr。 ? 沉降的速率與蛋白質(zhì)分子大小和密度有關(guān) ， 而且與分子形狀 、 溶液的密度和粘度有關(guān) 。 ? 蛋白質(zhì) 、 核酸 、 核糖體和病毒的沉降系數(shù)介于 1 1013 到 200 10 13 秒的范圍 。 沉降分析法測定相對分子質(zhì)量 ? 沉降平衡法 ? 利用沉降平衡法測定相對分子質(zhì)量是在較低速度（ 8000 20220r/min） 的離心場中進(jìn)行的 。 both the liquid surrounding the porous heads and that inside the beads. ? In contrast, the larger molecules have only the liquid surrounding the beads accessible to them, and thus move through the column faster