【正文】 25℃ ，溶解度隨溫度上升而將低。 低溫 （ 零下 4060度 ） 進行 ， 丙酮用量一般 10倍于蛋白質溶液體積 。這樣沉淀出的蛋白質保持著天然構象 ，能重新溶解于適當的 pH和一定濃度的鹽溶液中。 透析 —— 只用來除鹽類和小分子雜質 超過濾 （ ultrafiltration） 加壓 蛋白質溶液 半透膜 支持膜的柵板 超濾液 原理 :是利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子溶質通過半透膜，而蛋白質留在半透膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的 鹽析 (salt precipitation) 原理： 將硫酸銨 、 硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液 ， 使蛋白質 表面電荷被中和以及水化膜被破壞 ， 導致蛋白質沉淀 。 蛋白質的膠體性質 ? 蛋白質屬于生物大分子之一 ， 分子量范圍可達1萬至 100萬 之間 ， 其分子的直徑在 1~100 nm，為 膠粒 范圍之內 。蛋白質分離純化 2022328 蛋白質的酸堿性質 ? 蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基 側鏈中某些基團 ，在一定 pH的溶液中都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。 ?蛋白質的等電點 ( isoelectric point, pI) ? 當蛋白質溶液處于某一 pH時 ， 蛋白質解離成正 、 負離子的趨勢相等 ， 即成為兼性離子 ， 凈電荷為零 ， 此時溶液的 pH稱為蛋白質的等電點 。 ? 蛋白質膠體穩(wěn)定的因素 ? 顆粒表面電荷（雙電層） ? 水化膜 蛋白質分離純化的一般原則 ? 總目標：增加蛋白制品的 純度 或 比活 ? (pretreatment)： 因動 /植物 /細菌而異 ? (rough fractionation)： 采用鹽析 /等電點沉淀 /有機溶劑分級分離等方法 ? (fine frationation)： 采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等 ? ：分離純化的最后步驟 蛋白質的分離純化方法 根據蛋白質分子大小的差異分離 — 透析和超濾 根據蛋白質的溶解度差異分離 — 沉淀、鹽析等 根據蛋白質的電荷差異分離 — 電泳、離子交換等 根據蛋白質與某些物質的吸附差異 — 吸附分離 利用生物分子專一性結合的特性 — 親和層析 透析（ dialysis） 原理： 利用 蛋白質分子不能通過半透 而將其與小分子物質分開 常用的半透膜為 玻璃紙 或 纖維素材料 按照 分子大小 進行分離，分離取決于透析袋截留的分子量。 蛋白質脫去水化層而聚集沉淀 鹽析－ (NH4)2SO4 分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀 ， 加入少量鹽離子 后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中 鹽溶 等電點沉淀和 pH控制 ? 不同蛋白質具有不同的等電點，利用蛋白質在 等電點時溶解度最低 的原理，可以把蛋白質混合物分開。 有機溶劑分級分離 ? 丙酮 、 甲醇 、 乙醇等沉淀 : 能使蛋白質在水溶液中的溶解度將低 。 蛋白質被丙酮沉淀后 ，應立即分離 。在 40~50℃ 以上，大部分蛋白質變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性 pH介質中即失去溶解力。 層析也稱 色譜 ，基本原理是待分離蛋白質溶液在 流動相 的帶動下經過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據溶液中待分離的 蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力 等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經固定相而達到分離蛋白質的目的 。 層析 (chromatography)技術 層析的主要設備 常見色譜柱 自動分步收集器 ? 將作為固相成分的不溶性基質，例如葡聚糖凝膠、纖維素、樹脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。 ? 樣品中各種成分通過柱子取決于與固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脫出來，達到將各個成分分離的目的。其機理是分子篩效應，主要根據蛋白質分子的 大小 進行分離和純化。因此，混合樣品如同 “ 過篩 ” 一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。 凝膠過濾層析過程示意圖 凝膠過濾層析過程示意圖 優(yōu) 點 不帶電荷的惰性載體 。 操作條件較溫和 ， 不易引起生物物質的變性 ， 即使用來分離一些理化性質不穩(wěn)定的物質也很少被破壞 。 如果按比例擴大柱的體積和高度 ， 可進行大量樣品的分離純化 。 孔徑大小非常有限 ， 所以可被純化的物質的 分子量范圍受到限制 。 凝膠的結構與性能 凝膠也稱分子篩，是具有三維空間網狀結構的物質，有天然的，也可人工合成。 常用分子篩： 葡聚糖凝膠（ Sephadex） 型號： G200、 G150、 G100、 G7 G50、 G2 G15 分離大蛋白質 小蛋白質 除鹽 瓊脂糖凝膠 （瑞典 Sepharose、美國 BioGelA） 孔徑大，用于分離大分子物質 聚丙烯酰胺凝膠 （ BioGelP） 結構：葡聚糖用交聯劑 1氯 2,3環(huán)丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵 (COCH2CHCH2O)交聯聚合而成的 三維空間網狀結構 。 交聯劑的百分比高 ， 交聯度大 ， 網狀結構愈緊密 ， 孔隙愈小 ， 吸水后膨脹也愈小 ， 機械強度高 ， 分離物質的分子量也小 。 G類Sephadex的型號表示 每克干凝膠吸水量 ， 如 G50表示每克干凝膠吸水量為 5ml。 葡聚糖凝膠特點 它是一種 大孔凝膠 ， 其工作范圍的下限幾乎是 Sephadex的上限 ， 可分離 MW40萬以上 的物質 ， 因此可用來 分離核酸 及 病毒 。 瓊脂糖凝膠（商品名為 Sepharose) 使用 范圍及效果 同葡聚糖凝膠相似 ， 但化學性質較葡聚糖穩(wěn)定 ， 可在 pH 211范圍內使用 . 聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠 P（ BioGel P） ， 由美國 BioRod廠生產 ， 型號很多 ，從 P2至 P300共 10種 ， P后面的數字再乘 1000就相當于該凝膠的排阻限度 。 凝膠的選擇 凝膠的排阻極限 ? 排阻極限 是指不能進入凝膠顆粒孔穴內部的最小分子的分子量。 ? 排阻極限 代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到有效分離。 2022年中科院考研題 ? 今有 a、 b、 c、 d四種蛋白質，其分子體積由大到小的順序是 abcd，在凝膠過濾柱層析中，最先洗脫出來的蛋白質一般應該是（ ） ? A、 a ? B、 b ? C、 c ? D、 d 2022年中科院考研題 2022年上海師范大學考研題 ? 指出從分子排阻層析柱上洗脫下來下