蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)-免費(fèi)閱讀
【正文】 缺 點(diǎn) ? （ 1）由于各種蛋白質(zhì)中的 精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 ，因此 Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。 考馬斯亮藍(lán)法 (Bradford)法 ? 考馬斯亮蘭法是 1976年由 Bradford建立 的，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。在一定條件下，未知樣品的溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液同時(shí)反應(yīng)，并于 540560nm下 比色，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知的蛋白質(zhì)濃度， 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液可以用結(jié)晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。這就是最小分子量。待分離樣品可和梯度介質(zhì)先均勻混合，梯度介質(zhì)由于 離心力的作用 逐漸形成管 底部濃 而 管頂稀 的密度梯度，與此同時(shí)原來(lái)分布均勻的顆粒也發(fā)生重新分布。 ?① 差速離心法 (differential centrifugation) ② 密度梯度離心法 ? 亦稱 平衡密度梯度離心法 。S常用來(lái)近似描述生物大分子的大小，蛋白質(zhì)、核酸、核糖體和病毒的沉降系數(shù)介于 1 1013到200 1013S范圍 ，如人的 Hb沉降系數(shù)為 ，即為 1013S。 離心技術(shù) ? 離心是利用物體高速旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生 強(qiáng)大的離心力 ，使置于該旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒發(fā)生 沉降或漂浮 ，從而使某些顆粒達(dá)到濃縮或與其他顆粒分離之目的。 ? 該技術(shù)結(jié)合了根據(jù) 蛋白質(zhì)等電點(diǎn) 進(jìn)行分離的等電聚焦技術(shù) 以及根據(jù) 蛋白質(zhì)的大小 進(jìn)行分離的 SDSPAGE電泳技術(shù) 。 ? pH梯度不穩(wěn)定，隨時(shí)間的推移有向 陰極漂移的趨勢(shì) 。 當(dāng)它達(dá)到凈電荷是零的位置時(shí)才停止 。 ? 試預(yù)測(cè)這兩種蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)和 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的電泳結(jié)果。 ? pHpI 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，電泳中向正極移動(dòng) ? pHpI 蛋白質(zhì)帶正電荷，電泳中向負(fù)極移動(dòng) ? pH=pI 蛋白質(zhì)凈電荷為零，電泳中不動(dòng) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 支持物 :單體丙稀酰胺 (Acr) ? 交聯(lián)劑 :甲叉 (or亞甲 )雙丙稀酰胺 (Bis) ? 聚合 ? 光聚合 :核黃素 為催化劑 (陽(yáng)光 ,日光 ) 制大孔膠 ? 化學(xué)聚合 : 過(guò)硫酸銨 (NH4)2S2O3， 縮寫為 APS為催化劑 N,N,N’,N’,四甲基乙二胺 縮寫為 TEMED是加速劑用來(lái)制小孔膠 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 凝膠網(wǎng)孔大?。? 聚合鏈長(zhǎng)度 :由 Acr濃度決定 交聯(lián)程度 :由 Acr與 Bis相對(duì)比例決定 ? Bis的濃度低，孔徑大，可在聚合前調(diào)節(jié)單體與 Bis的濃度比 ?如 : Acr Bis T(%) 小孔 7% 大孔 % SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSpolyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）： ? 常用于 蛋白質(zhì)分 子量 的測(cè)定。它類似于分子篩，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多。 原 理 混合物中各組分在 固定相 和 流動(dòng)相 之間會(huì)發(fā)生 吸附、溶解 或 其他親和作用 ，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的 遷移速度不同 得到分離 高效液相色譜的主要類型 按分離機(jī)制的不同分為 四類： ? 液液 分配色譜法（ partition chromatography） ? 液固 吸附色譜法（ adsorption chromatography） ? 離子交換 色譜法（ IEC） ? 空間排阻 色譜法（ SEC） 液固吸附色譜法 固定相： 吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度 510μm 流動(dòng)相： 有機(jī)溶劑 適用于分離分子量 2001000的組分，大多數(shù)用于 非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構(gòu)體。 高速： 一般分析一次用幾分鐘到十幾分鐘。 氣相色譜分類 ? GC根據(jù) 固定相 不同又可分為 氣固色譜法 (GSC)和氣液色譜法 (GLC)，其中以 GLC應(yīng)用最廣。 特異結(jié)合在基質(zhì)上的靶蛋白最后可以用含有高濃度自由配體的溶劑洗下 。 2022年中科院考研題 ? 今有 a、 b、 c、 d四種蛋白質(zhì)，其分子體積由大到小的順序是 abcd，在凝膠過(guò)濾柱層析中，最先洗脫出來(lái)的蛋白質(zhì)一般應(yīng)該是（ ） ? A、 a ? B、 b ? C、 c ? D、 d 2022年中科院考研題 2022年上海師范大學(xué)考研題 ? 指出從分子排阻層析柱上洗脫下來(lái)下列蛋白質(zhì)時(shí)的洗脫順序，為什么？分離蛋白質(zhì)的范圍是5,000400,000。 葡聚糖凝膠特點(diǎn) 它是一種 大孔凝膠 ， 其工作范圍的下限幾乎是 Sephadex的上限 ， 可分離 MW40萬(wàn)以上 的物質(zhì) ， 因此可用來(lái) 分離核酸 及 病毒 。 凝膠的結(jié)構(gòu)與性能 凝膠也稱分子篩，是具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，有天然的，也可人工合成。 凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖 凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖 優(yōu) 點(diǎn) 不帶電荷的惰性載體 。 ? 樣品中各種成分通過(guò)柱子取決于與固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脫出來(lái)，達(dá)到將各個(gè)成分分離的目的。 蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后 ，應(yīng)立即分離 。 ?蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) ( isoelectric point, pI) ? 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一 pH時(shí) ， 蛋白質(zhì)解離成正 、 負(fù)離子的趨勢(shì)相等 ， 即成為兼性離子 ， 凈電荷為零 ， 此時(shí)溶液的 pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) 。這樣沉淀出的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象 ，能重新溶解于適當(dāng)?shù)?pH和一定濃度的鹽溶液中。 層析因固相介質(zhì)不同又分為 離子交換層析 、凝膠層析 和 吸附層析 等。 凝膠（ gel chromatography ）層析 ?單個(gè)凝膠珠本身象 “ 篩子 ” 。 缺 點(diǎn) 樣品和洗脫液的 粘度很低 。 反之 ,交聯(lián)劑的百分比低 ， 分離物質(zhì)的分子量大 。 所有大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出， 所以它們同時(shí)被最先洗脫出來(lái)。 配體通常指的是能與另一個(gè)分子或原子結(jié)合 （ 一般是非共價(jià)結(jié)合 ） 的分子 、 基團(tuán) 、 離子 、 或原子 。但本法必須針對(duì)某一分離對(duì)象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此 親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制 。主要通過(guò)選用高選擇性的固定液。 高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC) ? 也稱 高壓液相層析 （ high pressure liquid chromatography）。 ?應(yīng)用 離子交換色譜法主要用于分析陰，陽(yáng)離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來(lái)進(jìn)行
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