【正文】 缺 點 ? （ 1）由于各種蛋白質中的 精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 ，因此 Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差。 考馬斯亮藍法 (Bradford)法 ? 考馬斯亮蘭法是 1976年由 Bradford建立 的，是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。在一定條件下，未知樣品的溶液與標準蛋白質溶液同時反應，并于 540560nm下 比色，通過標準蛋白質的標準曲線求出未知的蛋白質濃度， 標準蛋白溶液可以用結晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。這就是最小分子量。待分離樣品可和梯度介質先均勻混合，梯度介質由于 離心力的作用 逐漸形成管 底部濃 而 管頂稀 的密度梯度，與此同時原來分布均勻的顆粒也發(fā)生重新分布。 ?① 差速離心法 (differential centrifugation) ② 密度梯度離心法 ? 亦稱 平衡密度梯度離心法 。S常用來近似描述生物大分子的大小，蛋白質、核酸、核糖體和病毒的沉降系數介于 1 1013到200 1013S范圍 ，如人的 Hb沉降系數為 ，即為 1013S。 離心技術 ? 離心是利用物體高速旋轉時產生 強大的離心力 ，使置于該旋轉體中的懸浮顆粒發(fā)生 沉降或漂浮 ，從而使某些顆粒達到濃縮或與其他顆粒分離之目的。 ? 該技術結合了根據 蛋白質等電點 進行分離的等電聚焦技術 以及根據 蛋白質的大小 進行分離的 SDSPAGE電泳技術 。 ? pH梯度不穩(wěn)定，隨時間的推移有向 陰極漂移的趨勢 。 當它達到凈電荷是零的位置時才停止 。 ? 試預測這兩種蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)和 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的電泳結果。 ? pHpI 蛋白質帶負電荷，電泳中向正極移動 ? pHpI 蛋白質帶正電荷，電泳中向負極移動 ? pH=pI 蛋白質凈電荷為零，電泳中不動 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 支持物 :單體丙稀酰胺 (Acr) ? 交聯劑 :甲叉 (or亞甲 )雙丙稀酰胺 (Bis) ? 聚合 ? 光聚合 :核黃素 為催化劑 (陽光 ,日光 ) 制大孔膠 ? 化學聚合 : 過硫酸銨 (NH4)2S2O3， 縮寫為 APS為催化劑 N,N,N’,N’,四甲基乙二胺 縮寫為 TEMED是加速劑用來制小孔膠 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 凝膠網孔大小： 聚合鏈長度 :由 Acr濃度決定 交聯程度 :由 Acr與 Bis相對比例決定 ? Bis的濃度低，孔徑大，可在聚合前調節(jié)單體與 Bis的濃度比 ?如 : Acr Bis T(%) 小孔 7% 大孔 % SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSpolyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）： ? 常用于 蛋白質分 子量 的測定。它類似于分子篩，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多。 原 理 混合物中各組分在 固定相 和 流動相 之間會發(fā)生 吸附、溶解 或 其他親和作用 ，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的 遷移速度不同 得到分離 高效液相色譜的主要類型 按分離機制的不同分為 四類： ? 液液 分配色譜法（ partition chromatography） ? 液固 吸附色譜法（ adsorption chromatography） ? 離子交換 色譜法（ IEC） ? 空間排阻 色譜法（ SEC） 液固吸附色譜法 固定相： 吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度 510μm 流動相： 有機溶劑 適用于分離分子量 2001000的組分，大多數用于 非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構體。 高速： 一般分析一次用幾分鐘到十幾分鐘。 氣相色譜分類 ? GC根據 固定相 不同又可分為 氣固色譜法 (GSC)和氣液色譜法 (GLC)，其中以 GLC應用最廣。 特異結合在基質上的靶蛋白最后可以用含有高濃度自由配體的溶劑洗下 。 2022年中科院考研題 ? 今有 a、 b、 c、 d四種蛋白質，其分子體積由大到小的順序是 abcd，在凝膠過濾柱層析中，最先洗脫出來的蛋白質一般應該是（ ） ? A、 a ? B、 b ? C、 c ? D、 d 2022年中科院考研題 2022年上海師范大學考研題 ? 指出從分子排阻層析柱上洗脫下來下列蛋白質時的洗脫順序，為什么？分離蛋白質的范圍是5,000400,000。 葡聚糖凝膠特點 它是一種 大孔凝膠 ， 其工作范圍的下限幾乎是 Sephadex的上限 ， 可分離 MW40萬以上 的物質 ， 因此可用來 分離核酸 及 病毒 。 凝膠的結構與性能 凝膠也稱分子篩，是具有三維空間網狀結構的物質，有天然的，也可人工合成。 凝膠過濾層析過程示意圖 凝膠過濾層析過程示意圖 優(yōu) 點 不帶電荷的惰性載體 。 ? 樣品中各種成分通過柱子取決于與固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脫出來，達到將各個成分分離的目的。 蛋白質被丙酮沉淀后 ，應立即分離 。 ?蛋白質的等電點 ( isoelectric point, pI) ? 當蛋白質溶液處于某一 pH時 ， 蛋白質解離成正 、 負離子的趨勢相等 ， 即成為兼性離子 ， 凈電荷為零 ， 此時溶液的 pH稱為蛋白質的等電點 。這樣沉淀出的蛋白質保持著天然構象 ，能重新溶解于適當的 pH和一定濃度的鹽溶液中。 層析因固相介質不同又分為 離子交換層析 、凝膠層析 和 吸附層析 等。 凝膠（ gel chromatography ）層析 ?單個凝膠珠本身象 “ 篩子 ” 。 缺 點 樣品和洗脫液的 粘度很低 。 反之 ,交聯劑的百分比低 ， 分離物質的分子量大 。 所有大于排阻極限的分子都不能進入凝膠顆粒內部，直接從凝膠顆粒外流出， 所以它們同時被最先洗脫出來。 配體通常指的是能與另一個分子或原子結合 （ 一般是非共價結合 ） 的分子 、 基團 、 離子 、 或原子 。但本法必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此 親和層析的應用范圍受到了一定的限制 。主要通過選用高選擇性的固定液。 高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC) ? 也稱 高壓液相層析 （ high pressure liquid chromatography）。 ?應用 離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行