【正文】 entrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)，也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。一般情況下，低速離心時(shí)常以 rpm來表示，超速離心則以 g表示 。 2DE儀器系統(tǒng) 恒溫水浴 垂直板電泳儀（第二向） 電源 等電聚焦儀（第一向） ?目前，第一向等電聚焦電泳普遍采用 預(yù)制的固定 pH梯度膠條 (immobilized pH gradient strips, IPG strips)。 電泳結(jié)束后的變化 所有的載體兩性電解質(zhì)分子以增加 pI級(jí)數(shù)的辦法將分別在陽、陰極之間到達(dá)它們自己的位置而給出一個(gè)pI梯度 。 ? 每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)合了許多的 SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。 極性較大組分滯留作用大，后流出。 當(dāng)層析系統(tǒng)的流動(dòng)相為氣體如氫、氦、氮，固相為涂漬在固體顆粒表面的液體時(shí)，此層析技術(shù)稱為氣液層析或氣液色譜 氣相色譜法的特點(diǎn) 應(yīng)用范圍廣 ： 氣象色譜法可以分析氣體和易揮發(fā)的物質(zhì) 高效： 可以分析沸點(diǎn)十分相近的組分，和極為復(fù)雜的多組份混合物。 離子交換層析的固相是 離子交換體 ， 包括 離子交換樹脂 、 離子交換纖維素 、 離子交換葡聚糖 。 常用分子篩： 葡聚糖凝膠（ Sephadex） 型號(hào)： G200、 G150、 G100、 G7 G50、 G2 G15 分離大蛋白質(zhì) 小蛋白質(zhì) 除鹽 瓊脂糖凝膠 （瑞典 Sepharose、美國 BioGelA） 孔徑大，用于分離大分子物質(zhì) 聚丙烯酰胺凝膠 （ BioGelP） 結(jié)構(gòu)：葡聚糖用交聯(lián)劑 1氯 2,3環(huán)丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵 (COCH2CHCH2O)交聯(lián)聚合而成的 三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 。其機(jī)理是分子篩效應(yīng)，主要根據(jù)蛋白質(zhì)分子的 大小 進(jìn)行分離和純化。 ? 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素 ? 顆粒表面電荷（雙電層） ? 水化膜 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 ? 總目標(biāo)：增加蛋白制品的 純度 或 比活 ? (pretreatment)： 因動(dòng) /植物 /細(xì)菌而異 ? (rough fractionation)： 采用鹽析 /等電點(diǎn)沉淀 /有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法 ? (fine frationation)： 采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等 ? ：分離純化的最后步驟 蛋白質(zhì)的分離純化方法 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差異分離 — 透析和超濾 根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度差異分離 — 沉淀、鹽析等 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷差異分離 — 電泳、離子交換等 根據(jù)蛋白質(zhì)與某些物質(zhì)的吸附差異 — 吸附分離 利用生物分子專一性結(jié)合的特性 — 親和層析 透析（ dialysis） 原理： 利用 蛋白質(zhì)分子不能通過半透 而將其與小分子物質(zhì)分開 常用的半透膜為 玻璃紙 或 纖維素材料 按照 分子大小 進(jìn)行分離，分離取決于透析袋截留的分子量。 ? 大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級(jí)分離操作一般都在 0℃ 或更低的溫度下進(jìn)行。 ， 重復(fù)性好 。 聚丙烯酰胺凝膠 選擇何種凝膠以及它的型號(hào) ， 這需要 根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件 ， 溶質(zhì)的分子量大小和分離工作的目的而定 ， 每種型號(hào)凝膠都有一定分離溶質(zhì)分子量的范圍 ， 選擇的型號(hào)凝膠要能 滿足實(shí)驗(yàn)要求 。 含配體溶液 收集目的蛋白 洗下未結(jié)合的蛋白 混合蛋白樣品 平衡液 帶有配體的樹脂珠（或膠粒） 優(yōu) 點(diǎn) ? 親和層析純化 過程簡(jiǎn)單 、 迅速 ，且 分離效率高 。 液相色譜 (liquid chromatograph, LC) ? LC同樣可分為 液固色譜法 (LSC)和 液液色譜法(LLC)。 凝膠色譜： （分子排阻色譜法 ） 凝膠色譜分離機(jī)理 HPLC的 特點(diǎn) ? 具有氣相層析的全部?jī)?yōu)點(diǎn)。 原 理 ? 等電聚焦 就是在電泳介質(zhì)中放入 載體兩性電解質(zhì) ，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽極到陰極逐步增加的 pH梯度 ，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于其相當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)位置上 ，也就是說被聚焦于一個(gè)狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點(diǎn)聚焦也稱為聚焦電泳。 IEFE的改進(jìn) ? 1982年， Bjellqvist等提出了 固相化 pH梯度（ immobilized pH gradients, IPG） ? 方法： 通過在灌膠時(shí)將丙烯酰胺緩沖液中加到聚丙烯酰胺凝膠中來產(chǎn)生 pH梯度。每個(gè)顆粒都有一定 大小、形狀、密度和質(zhì)量 。 速度區(qū)帶離心法 ? 在 離心前離心管內(nèi)預(yù)先裝入密度梯度介質(zhì) (如蔗糖、甘油、 KBr、 CsCl等 )，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部或梯度層中間，同梯度液一起離心。當(dāng)天然含氮有機(jī)物與 濃硫酸 共熱，分解出 碳、氫、氮形成二氧化碳、水及氨 ，產(chǎn)生的氨能夠與 硫酸 結(jié)合，生成硫酸銨，此過程稱為 “消化” 。 在 595nm下測(cè)定的吸光度值 A595， 與蛋白質(zhì)濃度成正比 。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。 ? 消化后，在凱氏定氮儀中加入 強(qiáng)堿 堿化消化液，使硫酸銨分解，放出氨 。沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈的區(qū)帶也越低。 沉降系數(shù) ? 沉降系數(shù)為顆粒在 單位離心力場(chǎng)作用下的沉降速度 ，是 1924年 Svedberg提出的。 固相化 pH梯度凝膠 (IPG)的優(yōu)點(diǎn) ? 避免陰極漂移： 因 pH梯度是 共價(jià)固定 于凝膠內(nèi)部的，具有更寬的 pH分離范圍，使過酸過堿的蛋白質(zhì)得到分離 ? 具有更高的負(fù)載蛋白質(zhì)的能力 ? 生產(chǎn)上重復(fù)性好 雙向電泳 (twodimensional electrophoresis, 2DE) ? 最早是由 Smithies和 Poulik提出，蛋白質(zhì)第一向根據(jù)其 自由遷移率， 在 濾紙條 上進(jìn)行的；第二向電泳方向與第一向垂直，在 淀粉膠 上進(jìn)行。 pH范圍： pH3~10 pH梯度的形成 載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物 ， 在通電后 ， 它們各自遷移到適當(dāng)位置形成一個(gè)連續(xù)的 pH梯度 。 ? 對(duì) 蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂 等尤為有利。 高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC) ? 也稱 高壓液相層析 （ high pressure liquid chromatography）。但本法必須針對(duì)某一分離對(duì)象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此 親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制 。 所有大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出， 所以它們同時(shí)被最先洗脫出來。 缺 點(diǎn) 樣品和洗脫液的 粘度很低 。