蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)(編輯修改稿)
2025-02-15 01:43 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 是指固定相對(duì)性質(zhì)極為相似的組份，如同位素，烴類的異構(gòu)體等有較強(qiáng)的分離能力。主要通過選用高選擇性的固定液。 高靈敏度： 指用高靈敏度的檢測(cè)器可檢測(cè)出 1011－ 1013克的物質(zhì)。因此可用于痕量分析。 高速： 一般分析一次用幾分鐘到十幾分鐘。某些快速分析中，一秒鐘可以分析若干份。色譜法易于自動(dòng)化．操作與處理都自動(dòng)化，速度很快。 液相色譜 (liquid chromatograph, LC) ? LC同樣可分為 液固色譜法 (LSC)和 液液色譜法(LLC)。此外還有 超臨界流體色譜法 (SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動(dòng)相 （常用 CO2）， 因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時(shí)間短， 特別適用于手性化合物的拆分。 高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC) ? 也稱 高壓液相層析 （ high pressure liquid chromatography）。這是近二十年內(nèi)發(fā)展起來的一項(xiàng) 快速、靈敏、高效 的分離技術(shù)。它是在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進(jìn)了氣相層析的理論，利用 高壓輸送流動(dòng)相，擁有高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器， 具有氣相層析的全部?jī)?yōu)點(diǎn)。 原 理 混合物中各組分在 固定相 和 流動(dòng)相 之間會(huì)發(fā)生 吸附、溶解 或 其他親和作用 ，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的 遷移速度不同 得到分離 高效液相色譜的主要類型 按分離機(jī)制的不同分為 四類： ? 液液 分配色譜法（ partition chromatography） ? 液固 吸附色譜法（ adsorption chromatography） ? 離子交換 色譜法（ IEC） ? 空間排阻 色譜法（ SEC） 液固吸附色譜法 固定相： 吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度 510μm 流動(dòng)相： 有機(jī)溶劑 適用于分離分子量 2001000的組分，大多數(shù)用于 非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構(gòu)體。 各組分的出峰順序 極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。 極性較大組分滯留作用大，后流出。 飽和烴 烯 芳烴 醚 醛酮 酸 液固吸附色譜分離機(jī)理 分離過程是一個(gè)吸附 —— 脫附的平衡過程。 ?固定相 ?將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面 ?化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的有機(jī)鍵合層，如C18（十八烷基硅烷）、 C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠 —— 常用 ?固定相類型 ?極性固定相： 正相色譜 ?非極性固定相： 反相色譜 液液分配色譜 正相色譜法 反相色譜法 1. 極性固定相 聚乙二醇 、 氨基與腈基鍵合相 2. 相對(duì)非極性流動(dòng)相 正已烷 、 環(huán)已烷 3. 極性調(diào)節(jié)劑 乙醇 、 四氫呋喃 、 三氯甲烷 4. 分離中等極性和極性較強(qiáng)化合物 . 酚類 、 胺類 、 羰基類及氨基酸類 5. 組分流出順序 極性小先洗出 1. 非極性固定相 C18（ 簡(jiǎn)稱 ODS） 、 C8 2. 極性流動(dòng)相 水或緩沖液 3. 極性調(diào)節(jié)劑 甲醇 、 乙腈 、 四氫呋喃 4. 分離非極性和極性較弱化合物 占整個(gè) HPLC應(yīng)用的 80%左右 5. 組分流出順序 極性大先洗出 液液分配色譜 離子交換色譜法 固定相： 離子交換樹脂，常用 苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上 羧基、磺酸基 構(gòu)成 陽離子交換樹脂 在表面未端芳環(huán)上接上 季胺基構(gòu)成 陰離子交換樹脂 流動(dòng)相： 電解質(zhì)溶液、有機(jī)弱酸或有機(jī)弱酸鹽溶液 ?分離原理 樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換而分離。 ?應(yīng)用 離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進(jìn)行分離。 ?分析物質(zhì) 有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。 離子交換色譜法分離機(jī)理 ? 以凝膠 (gel) 為固定相。它類似于分子篩，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多。 ? 小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長(zhǎng)；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。 ? 常用于分離 高分子化合物 ，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。 凝膠色譜： （分子排阻色譜法 ） 凝膠色譜分離機(jī)理 HPLC的 特點(diǎn) ? 具有氣相層析的全部?jī)?yōu)點(diǎn)。由于 HPLC分離能力強(qiáng) ，測(cè)定 靈敏度高 ， 選擇性高 ， 分析速度快 ，可在 室溫下進(jìn)行 ，故應(yīng)用范圍極廣， 無論是極性還是非極性，小分子還是大分子，熱穩(wěn)定還是不穩(wěn)定的化合物 均可用此法測(cè)定。 ? 對(duì) 蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂 等尤為有利。 電 泳 ? 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù) , 稱為電泳 (electrophoresis) 。 ? pHpI 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，電泳中向正極移動(dòng) ? pHpI 蛋白質(zhì)帶正電荷，電泳中向負(fù)極移動(dòng) ? pH=pI 蛋白質(zhì)凈電荷為零，電泳中不動(dòng) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 支持物 :單體丙稀酰胺 (Acr) ? 交聯(lián)劑 :甲叉 (or亞甲 )雙丙稀酰胺 (Bis) ? 聚合 ? 光聚合 :核黃素 為催化劑 (陽光 ,日光 ) 制大孔膠 ? 化學(xué)聚合 : 過硫酸銨 (NH4)2S2O3， 縮寫為 APS為催化劑 N,N,N’,N’,四甲基乙二胺 縮寫為 TEMED是加速劑用來制小孔膠 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 凝膠網(wǎng)孔大?。? 聚合鏈長(zhǎng)度 :由 Acr濃度決定 交聯(lián)程度 :由 Acr與 Bis相對(duì)比例決定 ? Bis的濃度低，孔徑大，可在聚合前調(diào)節(jié)單體與 Bis的濃度比 ?如 : Acr Bis T(%) 小孔 7% 大孔 % SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSpolyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）： ? 常用于 蛋白質(zhì)分 子量 的測(cè)定。 SDS （十二烷基磺酸鈉） ? SDS（十二烷基磺酸鈉） 是一種 陰離子型表面活性劑 ，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約 1 ? 。 ? 每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)合了許多的 SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。該法主要利用了 蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì) 。 ?
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