【文章內容簡介】 是指固定相對性質極為相似的組份，如同位素，烴類的異構體等有較強的分離能力。主要通過選用高選擇性的固定液。 高靈敏度： 指用高靈敏度的檢測器可檢測出 1011－ 1013克的物質。因此可用于痕量分析。 高速： 一般分析一次用幾分鐘到十幾分鐘。某些快速分析中，一秒鐘可以分析若干份。色譜法易于自動化．操作與處理都自動化，速度很快。 液相色譜 (liquid chromatograph, LC) ? LC同樣可分為 液固色譜法 (LSC)和 液液色譜法(LLC)。此外還有 超臨界流體色譜法 (SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相 （常用 CO2）， 因其擴散系數(shù)大，能很快達到平衡，故分析時間短， 特別適用于手性化合物的拆分。 高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC) ? 也稱 高壓液相層析 （ high pressure liquid chromatography）。這是近二十年內發(fā)展起來的一項 快速、靈敏、高效 的分離技術。它是在經典液相層析法基礎上，引進了氣相層析的理論，利用 高壓輸送流動相，擁有高效固定相及高靈敏度檢測器， 具有氣相層析的全部優(yōu)點。 原 理 混合物中各組分在 固定相 和 流動相 之間會發(fā)生 吸附、溶解 或 其他親和作用 ，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的 遷移速度不同 得到分離 高效液相色譜的主要類型 按分離機制的不同分為 四類： ? 液液 分配色譜法（ partition chromatography） ? 液固 吸附色譜法（ adsorption chromatography） ? 離子交換 色譜法（ IEC） ? 空間排阻 色譜法（ SEC） 液固吸附色譜法 固定相： 吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度 510μm 流動相： 有機溶劑 適用于分離分子量 2001000的組分，大多數(shù)用于 非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構體。 各組分的出峰順序 極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。 極性較大組分滯留作用大，后流出。 飽和烴 烯 芳烴 醚 醛酮 酸 液固吸附色譜分離機理 分離過程是一個吸附 —— 脫附的平衡過程。 ?固定相 ?將特定的液態(tài)物質涂于擔體表面 ?化學鍵合于擔體表面而形成的有機鍵合層，如C18（十八烷基硅烷）、 C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠 —— 常用 ?固定相類型 ?極性固定相： 正相色譜 ?非極性固定相： 反相色譜 液液分配色譜 正相色譜法 反相色譜法 1. 極性固定相 聚乙二醇 、 氨基與腈基鍵合相 2. 相對非極性流動相 正已烷 、 環(huán)已烷 3. 極性調節(jié)劑 乙醇 、 四氫呋喃 、 三氯甲烷 4. 分離中等極性和極性較強化合物 . 酚類 、 胺類 、 羰基類及氨基酸類 5. 組分流出順序 極性小先洗出 1. 非極性固定相 C18（ 簡稱 ODS） 、 C8 2. 極性流動相 水或緩沖液 3. 極性調節(jié)劑 甲醇 、 乙腈 、 四氫呋喃 4. 分離非極性和極性較弱化合物 占整個 HPLC應用的 80%左右 5. 組分流出順序 極性大先洗出 液液分配色譜 離子交換色譜法 固定相： 離子交換樹脂，常用 苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上 羧基、磺酸基 構成 陽離子交換樹脂 在表面未端芳環(huán)上接上 季胺基構成 陰離子交換樹脂 流動相： 電解質溶液、有機弱酸或有機弱酸鹽溶液 ?分離原理 樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換而分離。 ?應用 離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。 ?分析物質 有機酸、氨基酸、多肽及核酸。 離子交換色譜法分離機理 ? 以凝膠 (gel) 為固定相。它類似于分子篩，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多。 ? 小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。 ? 常用于分離 高分子化合物 ，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。 凝膠色譜： （分子排阻色譜法 ） 凝膠色譜分離機理 HPLC的 特點 ? 具有氣相層析的全部優(yōu)點。由于 HPLC分離能力強 ，測定 靈敏度高 ， 選擇性高 ， 分析速度快 ，可在 室溫下進行 ，故應用范圍極廣， 無論是極性還是非極性，小分子還是大分子，熱穩(wěn)定還是不穩(wěn)定的化合物 均可用此法測定。 ? 對 蛋白質、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂 等尤為有利。 電 泳 ? 蛋白質在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術 , 稱為電泳 (electrophoresis) 。 ? pHpI 蛋白質帶負電荷，電泳中向正極移動 ? pHpI 蛋白質帶正電荷，電泳中向負極移動 ? pH=pI 蛋白質凈電荷為零，電泳中不動 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 支持物 :單體丙稀酰胺 (Acr) ? 交聯(lián)劑 :甲叉 (or亞甲 )雙丙稀酰胺 (Bis) ? 聚合 ? 光聚合 :核黃素 為催化劑 (陽光 ,日光 ) 制大孔膠 ? 化學聚合 : 過硫酸銨 (NH4)2S2O3， 縮寫為 APS為催化劑 N,N,N’,N’,四甲基乙二胺 縮寫為 TEMED是加速劑用來制小孔膠 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 凝膠網孔大?。? 聚合鏈長度 :由 Acr濃度決定 交聯(lián)程度 :由 Acr與 Bis相對比例決定 ? Bis的濃度低，孔徑大，可在聚合前調節(jié)單體與 Bis的濃度比 ?如 : Acr Bis T(%) 小孔 7% 大孔 % SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSpolyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）： ? 常用于 蛋白質分 子量 的測定。 SDS （十二烷基磺酸鈉） ? SDS（十二烷基磺酸鈉） 是一種 陰離子型表面活性劑 ，它能夠與蛋白質多肽鏈中的氨基酸殘基按大約 1 ? 。 ? 每一個蛋白質分子都因為結合了許多的 SDS而帶有大量的負電荷，而蛋白質分子原有的電荷則可以忽略。該法主要利用了 蛋白質分子量大小不同而分離蛋白質 。 ?