【文章內(nèi)容簡介】 凝膠過濾的產(chǎn)物再過DNA affinitycolumn,比活力從510倍一下子提到了50~100倍。到了這一步，AP1可以占到蛋白量的 10~50%。 值得一提的是這個凝膠過濾層析。我們用的是SephacrylS300HR凝膠(一種聚 丙烯酰胺凝膠)，這種凝膠分辨范圍大概是10KDa到幾千KDa，但是這種凝膠是比較粗的一種介質(zhì)，分辨率不能跟superdex之類的比。大概由于不是那么精細，所以可以自己手工裝柱，我們用的柱子是Amersham的XK26/40(,高度40cm）。裝好的柱子分辨率真的是很低，AP1的洗脫體積跟空體積(voidvolume）相差挺小，而AP1只有40~50KD已經(jīng)很小了。這樣一來很多蛋白根本沒可能和AP1分開！這也就是為什么這一步純化倍數(shù)很小的原因。這樣一來，為什么要自找麻 煩做這又貴又麻煩的一步呢？原因在于這一步可以去掉核提取物里面的核酸酶，所以如果直接跑DNAaffinitycolumn,column上的DNAOligos會被降解掉！另外一個原因是，核提取物有一些可以和DNA非特異結(jié)合的蛋白，這些蛋白會飽和DNAaffinitycolumn，影響要轉(zhuǎn)錄因子的純化。 這個純化步驟說明，不同的純化手段必須加以精心組合才會有最好的效果。（十一）核抽提物 上回談到純化AP1轉(zhuǎn)錄因子的大致流程。其實在過柱子之前的核抽提物的準備 也是十分關鍵的。從天然產(chǎn)物中純化蛋白，如果大概知道蛋白在什么細胞器官，把 細胞器先分離出來作為純化的起始原料，可以省好多事情。因為細胞器官的分離的 方法已經(jīng)很成熟了。 　　核抽提物是怎么準備的呢？首先，融解Hela細胞。我們在這個模塊用的細胞都不 是自己長的，而是直接從一個公司Biovest買來的。據(jù)說這個公司有NIH的補貼， 所以價錢不貴。一升media的Hela細胞才要１７刀。凍存在80度的hela泡在有 glycerol的buffer里面，第一件事情就是要用有鎂離子的PBS來沖洗幾遍。然后用 一種低滲buffer來重懸細胞。這種低滲buffer鹽濃度很低，所以由于滲透壓的影響， hela細胞膜會變得比較脆弱。這個時候呢，把重懸的細胞用Dounce勻漿器處理一 下,把細胞膜弄破。低滲buffer里頭雖然鹽濃度很低，但也不是沒有鹽在里面。主要 有兩種成分，一個是10mMKCl,另一個是MgCl2。KCl沒有什么好說的， 可以換成NaCl。MgCl2就關鍵多了。鎂離子可以穩(wěn)定細胞核,讓細胞核不至于在破 碎細胞的時候就破裂。當然說是這么說，一些轉(zhuǎn)錄因子還是可能在勻漿的過程就漏出來。細胞膜破碎之后，細胞核還是基本完整的，細胞質(zhì)里面ER,Golgi之類的東東都漏出來了。然后再來一個低速離心。細胞核是比較重的，所以一離心，馬上就沉淀下來了。而其他細胞質(zhì)或者細胞膜的成分比較輕一些，還留在上清里面。 　　現(xiàn)在想起來，細胞器官的分離，幾乎無一例外都是利用細胞器比重不一樣來分離 的。細胞核是最好分離的了，因為比其他的膜結(jié)構(gòu)重得多。有些細胞器，比如要把Golgi和ER分開，是個十分麻煩的事情，因為比重相差太小了。有些時候，可以用一些古怪的辦法來分離。比如lysosome把，比重和線粒體及過氧化酶體很相近。一種辦法就是往一堆無辜的耗子注射一種特殊的去垢劑叫TritonWR1339。耗子根本不能分解吸收這種化合物，就積累在肝臟細胞的lysosome里面，使得lysosome比重變輕了一些，這樣就可以把lysosome從mitonchondria和peroxysome分出來了。話扯遠了，現(xiàn)在再回到AP1purification。 細胞核雖然被沉淀下來了，但里面還有很多染色質(zhì),如果DNA都降解漏出來，麻煩就大了。所以下一步就是用高鹽buffer(KCl)來破碎細胞核。核膜，染色質(zhì)之類的垃圾不能溶解，轉(zhuǎn)錄因子之類的蛋白卻能溶解。再一離心，取上清就行了。我們要的轉(zhuǎn)爐因子就在這里面。按理說，到這一步就可以上柱子了，但是這種上清溶液里面還有不少histoneH1，可以抑制體外轉(zhuǎn)錄反應。為了祛除hisone,我們又做了一步硫酸氨沉淀，histone由于太小，沉淀不下來，而轉(zhuǎn)錄因子什么的都可以被沉淀下來。沉淀重懸一下就可以跑SephacrylS300的柱子了。（十二）Gelfiltration的先天缺陷 上一篇講到核提取物。實驗的下一步就是跑SephacrylS300column。 這一步實驗是整個課程中第一次跑凝膠過濾色譜(gelfiltrationchromatography)， 我感覺還是很激動的。Gelfiltration是色譜中及其重要的一個種類。我先來談談 原理把。Gelfiltration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。這些微珠呢，并不是 實心的，而是有很多孔狀結(jié)構(gòu)。當?shù)鞍踪|(zhì)樣品經(jīng)過這些微珠的時候，如果蛋白質(zhì)分 子體積太大，不能通過微珠的孔狀結(jié)構(gòu)，就會繞過微珠，很快的被洗脫下來。如果 蛋白質(zhì)分子體積不是那么大，可以通過微珠的孔狀結(jié)構(gòu)，就會遲一些被洗脫下來。 這樣，蛋白質(zhì)分子可以根據(jù)大小而被gelfiltrationcolumn分開。 Gelfiltration和其他色譜方法一個顯著的不同是：Gelfiltration并不依賴 蛋白質(zhì)分子與柱材料的結(jié)合來分離蛋白。這個特點的一個好處是，所有的蛋白樣品 最后都能被洗脫下來，柱子重復用也不會有什么問題。但是這個特點也給Gelfiltration帶來了一個嚴重的缺陷：低分辨率。分辨率包括兩個因素，一個是兩個蛋白峰的距離，另一個是，蛋白峰的寬度。由于蛋白在gelfiltrationcolumn里面并不與柱材料相互結(jié)合，所以很容易擴散(diffusion)，擴散的結(jié)果就是蛋白峰非常寬。這個寬度非常要命，很多時候即使用了很好的柱子，蛋白頂峰也大致能分開,但是由于蛋白峰太寬，重疊在一起，這樣就很難分干凈。另外，兩個不同大小蛋白的洗脫體積的差別與分子量差別的對數(shù)呈線性關系，所以可以想見，如果分子量相近（比如只差兩三倍）的話，洗脫位置也會相近，Gelfiltration是很難把兩個蛋白完全分開的。 說一件我的糗事。有一次一個師妹遇到了一個難題，表達一個GSTtagged的蛋白 有一個降解產(chǎn)物。她想要的蛋白50kD,而那個降解的產(chǎn)物有30KD。她問我該怎么分開。我沒仔細想，就告訴她用Gelfiltration?，F(xiàn)在想起來，這實在是個昏招。當然，欣慰的是，該師妹最終沒有試gelfiltration,用別的方法解決了這個問題。:)　 如果要想蛋白峰寬度變窄一點，怎么辦呢？就樣品而言，體積越小越好，理想狀況是小于柱體積的２％。就柱子的材料而言，最主要的就是得把微珠做小一些，這樣空體積就會小一些，擴散就不會那么嚴重。另外柱子里的微珠大小均勻一些也會有幫助。這種改進帶來的一個問題就是，需要用FPLC之類的設備提供較高的壓力,柱子才跑得動。另外分辨率好的柱子往往不能手工裝，得買預裝的柱子，這樣就很貴（很貴很貴?。。。?。 　　嘮叨了一大堆，我想表達的一個中心意思就是：如果你想從一個蛋白質(zhì)混合物很干 凈的把一個蛋白純化出來，Gelfiltration是肯定沒戲的。雖然gelfiltration不能很精細的純化蛋白，但是它還有另兩個非常重要的用途。一個是脫鹽，另一個是確定蛋白大小。這兩個用途是其他種類的色譜沒法作到的。（十三）裝柱子的學問。 　上篇提到了Gelfiltration的基本原理，現(xiàn)在談談我裝柱子的過程。我們用的是Amersham 的XK26/40的空柱子，然后往里面填充SephacrylS300HR的resin。按道理說，要提高分辨率，柱子應該是越長越細才好，這種柱子雖然不短，但是挺粗的。但是一個好處就是，樣品體積可以大一些。 　　裝柱子本身就是一件很tricky的事情，以至與這課的教程上專門列了一小節(jié)來解釋怎么裝柱子。我們這一組人中，我負責裝柱子。一開始就是洗resin了，用粗制燒結(jié)玻板過濾的漏斗來洗，感覺這方法還挺快的。洗完了，就把resin重懸成50%的slurry，然后就是往柱子里頭倒了。但是呢，有一個小竅門，就是必須先封閉柱子的下出口，往柱子里面倒10%體積的buffer。我過去裝柱子犯傻，不知道要這么做，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下面的resin不均勻不說，還有一大堆氣泡。所以先加buffer是很必要的。倒slurry的時候還得用玻棒引流，這樣可以盡可能的避免氣泡。然后就是等了，等resin沉降３０分鐘后，就可以打開柱子的下出液口，讓多余的緩沖液流出去。液面低到靠近柱面的時候呢，就可以把上端液流接頭接到柱子上方。這個過程最麻煩了，主要是不能引入氣泡，所以先得讓這個接頭裝置里面充滿緩沖夜，把氣泡趕出來。我第一次做沒經(jīng)驗，費了九牛二虎之力才搞定了。然后就是接上蠕動泵(peristalticpump)加壓，讓resin繼續(xù)緊縮一下。隨著柱面的下降，接頭裝置還得不斷往下移動，使得接頭剛剛好與柱面接觸。接觸不緊密的話，等于是沖淡了樣品，分辨率會降低。 　　柱子裝好了，但還不能開始跑樣品。為什么呢？因為這種柱子的質(zhì)量必須很好才能起到分離蛋白的效果，否則是根本沒法work的。所以呢，首先得測試這個柱子是否真的裝好了。測試過程很簡單，就是跑一下藍色葡聚糖(bluedextran)，藍色葡聚糖是帶有藍色染料的多糖高分子聚合體，體積非常大，所以在空體積(voidvolume)就會洗脫出來。跑藍色葡聚糖可以起到三個目的。第一個就是確定voidvolume，知道這個空體積是很重要的。因為每次裝柱子，實際resin的總體積都會有微小的不同。特定蛋白在柱子的洗脫體積與空體積的比值是一定的，所以只要知道了空體積，就能知道蛋白大概會在什么時候洗脫出來。第二個就是確定樣品會被稀釋多少。第三個呢，是柱子是否裝的均勻。如果裝的不均勻，葡聚糖j就會跑得形狀怪異。一般來說呢，柱子下端堆積會比上端均勻，為了分辨度好，應該從更均勻的一端上樣。所以我們在做的時候，是從下端上樣的。 　　忙活了半天，當所有裝置都裝好的時候，感覺還是挺興奮的。首先是蠕動泵，然后是柱子，然后是UVmonitor加記錄儀。整套裝置不貴，功能卻很齊全。（十四）anfinsen的疑慮 　 　　跑完sephacryl柱子，組分就可以過DNAaffinitycolumn。DNAaffinitycolumn雖然很重要，但是這一步技術(shù)上來說要求很低。買來CNBR活化好的agarose，然后讓特定序列的寡聚核苷酸固定上去就行了，柱子也是最簡單便宜的一次性柱子。 　親合層析是目前最常用也最強大的一種蛋白質(zhì)純化技術(shù),純化效率比別的層析方法可以高出一兩個數(shù)量級。這種方法誕生是六十年代的事情。當時是在NIH的Anfinsen實驗室。Anfinsen是一個諾貝爾獎獲得者，可以說是蛋白質(zhì)折疊研究的老祖宗。他主要貢獻是通過研究ribonuclease的變性和重折疊證明氨基酸序列就可以決定蛋白質(zhì)最后的三維結(jié)構(gòu)。他實驗室那時侯有一個學生一個project是從葡萄球菌里面提取大量核酸酶，然后研究enzyme/inhibitorinteraction。這個純化可是很麻煩的事情，用gelfiltration,ionexchange,hydrophobicinteraction,　效率都很低。有人可能會問，然后用 Ni beads純化?。看鸢负芎唵?，那個時候根本沒有molecularcloning這些技術(shù)，也沒Nibeads這些東西，Nibeads也是親合層析的一種，是好多年以后才發(fā)明的。這個學生有一天突發(fā)奇想，既然inhibitor可以與enzyme結(jié)合，為什么不能把inhibitor固定在beads上面，然后用來純化蛋白呢？后來他試了一把，結(jié)果非常成功。搞笑的是，anfinsen自己很懷疑這個技術(shù)是否能work,勉強答應把自己名字署在在那個學生的文章，還強調(diào)如果沒有別人能重復，自己心就是懸著的。呵呵。從此以后，各種各樣的親合層析層出不窮，成為生物實驗室蛋白質(zhì)純化的最主要工具。 　　八卦完歷史，現(xiàn)在介紹一下親合層析的種類。通用的親合層析包括IMAC(ImmobilizedMetalAffinityChromatography)和IAC(ImmunologicalAffinityChromatography)。這些東東 大家應該都熟，類似于Ni beads , proteinAbeads 之類的東西， 幾乎所有人都會用到。需要動點腦筋的是一些利用特定蛋白質(zhì)特定性質(zhì)的親合層析。比如我們實驗室研究的糖基轉(zhuǎn)移酶把，有兩個反應底物，一個是nucleotidesugar,另一個是一個小蛋白質(zhì)EGF repeats。 由于這個酶與兩個底物都有結(jié)合， 所以可以把這兩種底物分別結(jié)合在beads上，然后跑兩次親合層析。AP1的純化呢，則是利用了轉(zhuǎn)錄因子與DNA序列的特異結(jié)合。所以呢，在做親合層析之前，一定要根據(jù)蛋白質(zhì)本身的特點來選擇相應的ligand。決定了ligand之后呢，就得考慮怎么把ligand偶連在beads上了。 CNBr活化是最常用的一個方法。原理很簡單，CNBr的碳對beads上的羥基發(fā)起親電進攻，產(chǎn)生一種叫cyclicimidocarbonate的中間產(chǎn)物,蛋白質(zhì)或者核酸的伯胺基團(primaryamine,NH2) 與其發(fā)生反應， 形成共價鍵聯(lián)在beads上。 蛋白質(zhì)的primaryamine主要來自于lysine,如果要偶連的蛋白沒有l(wèi)ysine用這種偶連方法就不好。DNA的primaryamine來自于AGC三種堿基。DNA是雙鏈互補的結(jié)構(gòu)，堿基上的primaryamine都要形成氫鍵。所以呢，要想把DNAoligo固定好，必須 得有不配對的overhang才行。這是一個小竅門，但是給我們的一個啟示是，要做好affinityresin, 了解一些基本的偶連方法的化學原理是很有用的?！。ㄊ澹〢P1的活性測定 　　　第二個模塊的實驗，DNAaffinitychromatography之后我們又跑了一個更精細的 Gelfiltration，用的是Amersham賣的Superose6預裝柱子。純化步驟就只有這么多了。剩下的就是一些活性測定。無論是sephacryl分出來的