【正文】 5%TGE+35%TGE+45%由于GFP折疊好了才能發(fā)熒光，用一個fluorescencereader，我們可以實時監(jiān)控折疊的效果。相比之下，TGE的四種溶液都很好，GFP重折疊的效率是hampton kit的幾十倍。glycerol。HC變性還是用sarkosyl來變性，TGE+glycerol實驗結果出來后，看著我們驚訝的表情，Burgess臉上都笑開花了，呵呵。很多kit吹得很牛，但并不一定真的好用?！⊥砩厦刻於加腥俗鰣蟾妫矣X得讓我收獲最大的是Bill本來這個報告是后來才聽到的，但是由于Burgess的模塊是唯一的涉及大腸桿菌鐘表達蛋白的，我把這一段提前來說說。National噬菌體，也是T7polymerasesystem(pET T7長話短說，pET系列的質粒都用T7T7RNA識別，而這個咚咚大腸桿菌是沒有的。promoter和lacRNA基因片斷。來誘導T7polymerase這個系統非常強大，原因 在于T7polymerase工作起來非常有效率，效率高到什么地步呢？就是表達一個蛋白，表達量可以占到大腸桿菌總蛋白量的50%! 這一點我深有體會。妖怪的是，用質粒轉化蛋白表達菌株BL21(DE3)怎么也不能轉化，鋪的板一個菌落也沒有。我來來回回一共轉化了五六次，最后終于找到了唯一的一個菌落。這個問題到了bill原來我們一般用的LBTryptone是caseine的酶解產物，而casein又是milk里提取而來。有乳糖(lactose)，tryptone里面也有乳糖的污染。studier研究發(fā)現即使很微量的lactose也能有效的誘導蛋白表達。有意思的是，細菌有一種很有意思的特點，如果培養(yǎng)基里有足量的glucose，細菌會優(yōu)先攝取glucose,而不能攝取lactose。studier根據這個特點研究出一種可以自動誘導的培養(yǎng)基。和細菌首先攝取glucose，不攝取lactose,當細菌長到一定密度，耗完glucose之后，就開始攝取lactose,從而開始誘導表達。 　最后Bill氧氣是限制細菌生長最重要的瓶頸,大腸桿菌的密度可以從一般的OD600翻十倍到20~30!要提高培養(yǎng)瓶的供氧，可以用baffled這種flask的瓶底邊緣有幾處凹陷(類似于可樂塑料瓶底那樣的形狀)，能有效增加空氣培養(yǎng)基的混合。Proteinand41:(2005) 　　Bruce是冷泉港的現任主管，是一個絕對的牛人。他是澳洲人，在美國待了N年，卻從沒有加入美國國籍，所以他只是外籍院士。他主要研究真核生物的DNA復制。在報告里面，他特別提到了表達純化CDC6蛋白的經歷，我覺得十分有意思。用他的話說，是ainass。真核生物的DNA有多個復制起始位點 (replicationReplicationORC在整個細胞周期里面都是與DNA結合的。protein這個plex一旦形成，DNA 　Stillman但是到了CDC6，他們碰到了大麻煩。然后他們嘗試用大腸桿菌來表達。然后他們嘗試在室溫下誘導表達，發(fā)現蛋白雖然可溶了，但是都被降解了。tag,這下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是還是沒有活性。所以呢，他們重新做了一個construct,在GST和CDC6序列中間加了一個蛋白酶切割位點。有GST的CDC6是可溶的，可是一旦把GST切掉了，CDC就沉淀出來了....%^amp。他猜到這個蛋白可能很不穩(wěn)定，對緩沖液要求可能很高，所以他讓一個本科生連續(xù)試了十多種buffer，最后發(fā)現如果用磷酸鉀＋谷氨酸鉀緩沖液，切掉GST之后CDC6就不會沉淀了?？赡茏孋DC6更穩(wěn)定。卻就這一點小trick!Stillman實驗室正在準備一篇文章要投到nature上去。 試Gudn我們接著試了用sarkosyl做 變性劑的蛋白重折疊。效果好了很多，至少沒有渾濁現象了。50，一種陽離子交換柱，來把可溶的sigma為什么這一次用Poros50再加上sigma32 很奇怪，既有負電的表面，又有帶正電的表面，所以可以用陽離子交換柱。 　　好了，聊完離子交換柱，現在回到Dr Sigma32在大腸桿菌過表達的時候，絕大部分都是inclusion這些可溶的sigmaRNA我們這個實驗就是要把這個復合體純化出來。但是為了提高純化的效果，Burgess要我們提前用PEI沉淀的辦法來粗分一下。是什么呢？就是polyethyleneimine這個東東我過去沒碰到，所以很感興趣。由于這種結合是受離子強度影響的，感覺上很象DEAE那之類的性質，所以Burgess稱之為液體DEAE。polymerase和DNA是結合的，所以PEI沉淀DNA的同時，把RNA然后再用高鹽洗脫蛋白質，而DNA和PEI結合很緊密，所以還是在沉淀里面。到了這一步，還有一個問題。所以下一步就是用硫酸胺沉淀的辦法把蛋白和PEI分開。免疫親合柱就沒有什么好說的了。bluepolymerase的各個亞基。沉淀，沉淀，沉淀 上一部分我匆匆提到了用硫酸氨沉淀來去掉PEI(Polyethyleneimine）的步驟。但其實這種沉淀是蛋白質純化中及其重要的一種方法。 硫酸氨沉淀是怎么做的呢？其實很簡單，把磨細了的硫酸氨粉末往樣品溶液里 倒就行了，蛋白就會相繼沉淀下來。這種方法對大量樣品尤其好 用，因為比較方便快捷便宜。 其實沉淀蛋白質的方法有很多種，但是對于嬌貴的蛋白質來說，很多常用方法 都太harsh了。TCA是個強酸，施放出 來的質子中和了蛋白質的負電荷，只留下正電荷與TCA形成不溶物，從而變性。 out）。在低鹽濃度下，如果增加鹽濃度，會增強蛋白質的溶解，這是因為，鹽的離子與蛋白質表面的正負電荷配對，減少了蛋白質電荷表面相互作用的機會。 硫酸氨如果運用的好可以幫很大的忙。Burgess講過一個例子。這個公司是做單抗的，有一個工序是要從ascites里 頭把抗體給純化出來。Burgess很驚訝的發(fā)現，這個公司竟然沒有做仔細的分析，就隨便用了一個很高的硫酸氨濃度，結果把抗體和serum但是其實可以用一個低一點的濃度，只把serumalbumin分開。albumin濃度是非常高的了，這樣一分，大大提高了后續(xù)純化步驟的效率。Dr.因為是否能沉淀下來跟蛋白質濃度有關系，而每次樣品內目標蛋白的濃度不一定一樣。把樣品分成五份，每份分別加硫酸氨至20%,40%,60%,30%到40%,50%到60%,看看目標蛋白到底在 哪里，就完事了。永遠的轉錄因子 　　　 　第一個模塊的實驗結束以后，我們進入第二個模塊的實驗。Courey。AP1是一種很重要的sequenceAP1其實不是一種均一的蛋白質，實際上一種二聚體結構，要么 是JunJundimer。helix的結構。Zipper的結構，而helix另一邊就是堿性的氨基酸居多，所以可以和DNA 結合。 　sequence這個模塊涉及的一些實驗是最經典的一些分離轉錄因子的方法，所以很有用。決定了這個，才能有一個活性檢測系統，才能真正開始純化。 　整個純化過程是這樣的：首先制備Hela細胞的核提取物，然后用硫酸氨沉淀的辦法粗分一下組分，小分子量蛋白(比如Histone因為無法沉淀而被去掉。然后粗分的產物再跑一下凝膠過濾層析，比活力再提高到初始產物的5到10倍。column,到了這一步，AP1可以占到蛋白量的 10~50%。值得一提的是這個凝膠過濾層析。S300凝膠(一種聚 丙烯酰胺凝膠)，這種凝膠分辨范圍大概是10KDa到幾千KDa，但是這種凝膠是比較粗的一種介質，分辨率不能跟superdex之類的比。高度40cm）。volume）相差挺小，而AP1只有40~50KD已經很小了。這樣一來，為什么要自找麻 煩做這又貴又麻煩的一步呢？原因在于這一步可以去掉核提取物里面的核酸酶，所以如果直接跑DNAcolumn,Oligos會被降解掉！另外一個原因是，核提取物有一些可以和DNA非特異結合的蛋白，這些蛋白會飽和DNAcolumn，影響要轉錄因子的純化。（十一）核抽提物 上回談到純化AP1轉錄因子的大致流程。從天然產物中純化蛋白，如果大概知道蛋白在什么細胞器官，把 細胞器先分離出來作為純化的起始原料，可以省好多事情。 　　核抽提物是怎么準備的呢？首先，融解Hela細胞。買來的。一升media的Hela細胞才要１７刀。然后用 一種低滲buffer來重懸細胞。這個時候呢，把重懸的細胞用Dounce低滲buffer里頭雖然鹽濃度很低，但也不是沒有鹽在里面。KClKCl沒有什么好說的， 可以換成NaCl。就關鍵多了。讓細胞核不至于在破 碎細胞的時候就破裂。細胞膜破碎之后，細胞核還是基本完整的，細胞質里面ERGolgi之類的東東都漏出來了。細胞核是比較重的，所以一離心，馬上就沉淀下來了。 　　現在想起來，細胞器官的分離，幾乎無一例外都是利用細胞器比重不一樣來分離 的。有些細胞器，比如要把Golgi和ER分開，是個十分麻煩的事情，因為比重相差太小了。比如lysosome把，比重和線粒體及過氧化酶體很相近。WR1339。話扯遠了，現在再回到AP1purification。所以下一步就是用高鹽buffer(核膜，染色質之類的垃圾不能溶解，轉錄因子之類的蛋白卻能溶解。我們要的轉爐因子就在這里面。H1，可以抑制體外轉錄反應。我們又做了一步硫酸氨沉淀，histone由于太小，沉淀不下來，而轉錄因子什么的都可以被沉淀下來。S300filtration的先天缺陷 上一篇講到核提取物。S300 這一步實驗是整個課程中第一次跑凝膠過濾色譜(gelchromatography)， 我感覺還是很激動的。filtration我先來談談 原理把。filtration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。當蛋白質樣品經過這些微珠的時候，如果蛋白質分 子體積太大，不能通過微珠的孔狀結構，就會繞過微珠，很快的被洗脫下來。 這樣，蛋白質分子可以根據大小而被gelcolumn分開。filtrationfiltration這個特點的一個好處是，所有的蛋白樣品 最后都能被洗脫下來，柱子重復用也不會有什么問題。filtration帶來了一個嚴重的缺陷：低分辨率。由于蛋白在gelcolumn里面并不與柱材料相互結合，所以很容易擴散(diffusion)，擴散的結果就是蛋白峰非常寬。但是由于蛋白峰太寬，重疊在一起，這樣就很難分干凈。filtration是很難把兩個蛋白完全分開的。有一次一個師妹遇到了一個難題，表達一個GSTtagged的蛋白 有一個降解產物。她問我該怎么分開。filtration。當然，欣慰的是，該師妹最終沒有試gel用別的方法解決了這個問題。就柱子的材料而言，最主要的就是得把微珠做小一些，這樣空體積就會小一些，擴散就不會那么嚴重。這種改進帶來的一個問題就是，需要用FPLC之類的設備提供較高的壓力,另外分辨率好的柱子往往不能手工裝，得買預裝的柱子，這樣就很貴（很貴很貴?。。。?。filtration是肯定沒戲的。filtration一個是脫鹽，另一個是確定蛋白大小。 　上篇提到了Gel我們用的是Amersham 的S300的resin。但是一個好處就是，樣品體積可以大一些。我們這一組人中，我負責裝柱子。洗完了，就把resin重懸成50%的slurry，然后就是往柱子里頭倒了。我過去裝柱子犯傻，不知道要這么做，結果發(fā)現下面的resin所以先加buffer是很必要的。然后就是等了，等resin液面低到靠近柱面的時候呢，就可以把上端液流接頭接到柱子上方。我第一次做沒經驗，費了九牛二虎之力才搞定了。pump)隨著柱面的下降，接頭裝置還得不斷往下移動，使得接頭剛剛好與柱面接觸。 　　柱子裝好了，但還不能開始跑樣品。所以呢，首先得測試這個柱子是否真的裝好了。dextran)，藍色葡聚糖是帶有藍色染料的多糖高分子聚合體，體積非常大，所以在空體積(void跑藍色葡聚糖可以起到三個目的。volume，知道這個空體積是很重要的。特定蛋白在柱子的洗脫體積與空體積的比值是一定的，所以只要知道了空體積，就能知道蛋白大概會在什么時候洗脫出來。第三個呢，是柱子是否裝的均勻。一般來說呢，柱子下端堆積會比上端均勻，為了分辨度好，應該從更均勻的一端上樣。 　　忙活了半天，當所有裝置都裝好的時候，感覺還是挺興奮的。monitor加記錄儀。（十四）anfinsen的疑慮 　 　　跑完sephacryl柱子，組分就可以過DNAcolumn。affinity買來CNBR活化好的agarose，然后讓特定序列的寡聚核苷酸固定上去就行了，柱子也是最簡單便宜的一次性柱子。純化效率比別的層析方法可以高出一兩個數量級。當時是在NIH的Anfinsen實驗室。他主要貢獻是通過研究ribonuclease他實驗室那時侯有一個學生一個project是從葡萄球菌里面提取大量核酸酶，然后研究enzyme/inhibitor這個純化可是很麻煩的事情，用gelionexchange,interaction,　效率都很低。cloning這個學生有一天突發(fā)奇想，既然inhibitor可以與enzyme結合，為什么不能把inhibitor搞笑的是，anfinsen自己很懷疑這個技術是否能work,呵呵。 　　八卦完歷史，現在介紹一下親合層析的種類。MetalChromatography)和IAC(ImmunologicalChromatography)。 proteinA需要動點腦筋的是一些利用特定蛋白質特定性質的親合層析。EGF repeats。AP1的純化呢，則是利用了轉錄因子與DNA序列的特異結合。決定了ligand之后