【正文】 oside的去垢劑，親水基團(tuán)是糖或者糖的衍生物，有可能與凝集素結(jié)合，降低凝集素的純化效果。比如ConAagarose常常被用來(lái)純化具有Highmannosetype　Nglycan的蛋白質(zhì)，與mannose和glucose都能結(jié)合。如果此時(shí)用Octyl glucoside，就無(wú)法純化蛋白了，因?yàn)镺ctylglucoside的親水基團(tuán)是一個(gè)glucose。(5)是否需要用弱的去垢劑來(lái)去掉solubleprotein?有時(shí)候用去垢劑并非完全是用來(lái)溶解膜蛋百，其實(shí)也可以用來(lái)去掉一些可溶蛋白雜質(zhì)。比如Sodiumcholate是一種很弱的去垢劑，雖然不能用來(lái)很有效的溶解insulinreceptor之類(lèi)的膜蛋白,但是可是用來(lái)處理plasmamembraneprep,去掉大量的可溶蛋白雜質(zhì)。(6)是否需要用去垢劑來(lái)做Twophasepartitioning？TritonX114是一種很特別的去垢劑，在室溫下很容易溶解在水中，但是在３０攝氏度以上會(huì)從水相中脫離出來(lái)，并且連帶的把膜蛋白也一起拽出來(lái)。這樣呢，就可以把膜蛋白和可溶蛋白分開(kāi)。這種方法叫做，twophasepartitioning。我并不太喜歡這種方法，因?yàn)橛幸唤M人做了這個(gè)實(shí)驗(yàn)，感覺(jué)分得并不是那么干凈，在可溶相還是有不少insulinreceptor。(7)去垢劑的用量是否足夠?要充分的溶解膜蛋白，去垢劑的用量必須足夠才行。我們?cè)谠囼?yàn)中，先測(cè)了一下起始樣品的蛋白總濃度，然后以detergent:protein5:1的比例加去垢劑。(8)選用的去垢劑是否影響所純化蛋白的活性？有些情況下，某些十分嬌貴的蛋白質(zhì)對(duì)一些去垢劑很敏感。問(wèn)題是,很難預(yù)先就知道那種去垢劑會(huì)降低蛋白活性。但是，我覺(jué)得大家至少得意識(shí)到，去垢劑很有可能干擾蛋白活性的。我舉一個(gè)例子。我是做糖基轉(zhuǎn)移酶的。有一種酶叫ProteinOmannosyltransferase1是一種膜蛋白，跟musculardystrophy有關(guān)系，是一個(gè)研究熱點(diǎn)。很多實(shí)驗(yàn)室都懷疑這種蛋白是糖基轉(zhuǎn)移酶，但是很長(zhǎng)一段時(shí)間里面，很多實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)表達(dá)的重組蛋白都沒(méi)有活性。一直到前兩年，終于有一個(gè)實(shí)驗(yàn)室證明了這個(gè)蛋白是有活性的。之所以很多實(shí)驗(yàn)室之前都不成功，其中一個(gè)重要因素就是去垢劑。TritonX100和NP40是很常用的去垢劑。這個(gè)成功的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，如果用常規(guī)濃度下的TritonX100，表達(dá)的ProteinOmannosyltransferase完全沒(méi)有活性，相比之下用了Octylthioglucoside就有活性了！所以呢，如果大家試圖表達(dá)一個(gè)膜蛋白，卻沒(méi)有活性，不妨換一下去垢劑，說(shuō)不定會(huì)有意外的驚喜。（十八）凝集素層析我們用去垢劑溶解了膜蛋白之后，緊跟著的一步就是用WheatGermAglutinin(WGA)agarose來(lái)部分純化insulinreceptor。WGA是凝集素(Lectin）中的一種，而Lectin指的是可以與糖基結(jié)合的蛋白質(zhì)。現(xiàn)在常用來(lái)做蛋白質(zhì)純化的凝集素絕大部分是從植物中提取出來(lái)的。絕大部分膜蛋白的extracellulardomain和分泌蛋白都有Nlinkedglycan的糖基修飾。根據(jù)這個(gè)性質(zhì)，用固定有適當(dāng)?shù)哪氐腷eads，比如WGAagarose或者ConAagarose可以部分提純膜蛋白。注意，只能是部分提純，凝集素層析并不能一步登天，讓蛋白質(zhì)比活力一下子提高上千倍，至多幾十倍就已經(jīng)很不錯(cuò)了。但盡管如此，凝集素層析是一種很好的辦法，因?yàn)閎uffer條件非常溫和，洗脫液是加了糖的buffer，透析什么的也方便，非常非常適合于和其他層析方法偶連起來(lái)用。純化膜蛋白用的最主要的兩種凝集素是WGA和ConA。談到這里，我先向大家介紹一下Nlinkedglycans。Nlinkedglycans 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常見(jiàn)的一種糖基修飾。 這種糖基是加在膜蛋白的extracellulardomain上面。如果膜蛋白有這個(gè)sequence,NXS/T,最前面的Asparagine多半被Nglycan修飾。Nglycan是一個(gè)Oligosaccharide 結(jié)構(gòu)，好像一個(gè)分叉的樹(shù)枝一樣。膜蛋白的新生肽鏈在被翻譯合成的同時(shí)會(huì)被直接塞入ERlumen，同時(shí)就會(huì)被加上一整個(gè)樹(shù)枝狀的Nglycancore。這個(gè)Nglycan加上去之后，并不是就大功告成了，而是要經(jīng)歷一系列“裁減”，有的糖基會(huì)被去掉，新的糖基又會(huì)被加上，這樣最后的Nglycanstructure往往是千奇百怪。 但是Nglycan的“主干”都是相似的.Man　　　Man\/\Man/|GlcNAc|GlcNAc|NXS/TMan代表Mannose甘露糖，而GlcNAc代表N乙酰葡萄糖胺.保留在ER或者CisGolgi的膜蛋白,Nglycan往往是Highmannosetype。在這種Nglycan的末端有很多甘露糖(mannose)修飾。最適合于純化這種蛋白的凝集素是ConA。ConA主要識(shí)別alphamannose,alphaglucose和alphaGlcNAc,所以可以這三種糖溶液來(lái)做洗脫液。分泌出去的蛋白，或者已經(jīng)到細(xì)胞表面的膜蛋白的Nglycan往往是plextype。這種plextypeNglycan的末端往往修飾有Sialicacid（唾液酸，一種帶負(fù)電的糖）和GlcNAc。而WGA主要識(shí)別GlcNAc和Sialicacids，所以特別適合于純化這種類(lèi)型的蛋白，洗脫液可以用GlcNAc和Sialicacid溶液。最后需要指出來(lái)是，純化一種特定蛋白，選擇用什么凝集素是完全經(jīng)驗(yàn)性的，需要提前測(cè)試才知道的。?。ㄊ牛㎝DABF1的啟示凝集素層析實(shí)際操作起來(lái)很簡(jiǎn)單，跟過(guò)簡(jiǎn)單的Ni柱子一樣。拿到洗脫的蛋白之后，我們就著手開(kāi)始測(cè)活，分析純化的效率和倍數(shù)。胰島素受體不是酶，所以測(cè)活是利用胰島素與受體的特異結(jié)合。具體的測(cè)活步驟非常簡(jiǎn)單，就是把I125標(biāo)記的胰島素和純化的組分混合然后孵育一段時(shí)間。然后加PEG（PolyethyleneGlycol)6000沉淀胰島素受體，而游離的胰島素不會(huì)被沉淀下來(lái)。說(shuō)到PEG沉淀。是這樣的，她實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一個(gè)蛋白質(zhì)因子MDABF1。這個(gè)因子對(duì)Osteoblast（成骨細(xì)胞）的增長(zhǎng)有促進(jìn)作用。 然后呢，她就想把這個(gè)因子的受體給找出來(lái)。首先一步呢，就是得有一個(gè)測(cè)活方法。所以她就比照insulinreceptor的測(cè)活方法而設(shè)計(jì)了一個(gè)方法,其中連PEG沉淀都是一樣的。結(jié)果呢，這個(gè)測(cè)活試驗(yàn)完全失敗了。問(wèn)題出在PEG沉淀這一步。PEG作為一種多元醇，可以想像為一種“分子海綿”，可以吸附水分子。這樣樣品中蛋白的有效濃度實(shí)際變大了好多，容易出現(xiàn)聚集然后沉淀的現(xiàn)象。這就是為什么insulinereceptor可以被沉淀下來(lái)的原因。而游離的胰島素本身分子量很小，只有不到10KD，而且非常易溶，所以即使加了PEG，也沉淀不下來(lái)。而Dr.Lin發(fā)現(xiàn)的MDABF1因子，分子量相對(duì)insulin大了好多，有50多KD，所以游離的因子也能被PEG沉淀下來(lái)。聽(tīng)完這個(gè)小插曲，我感覺(jué)挺吃驚，作為一個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的教授，所以呢，我感覺(jué)做實(shí)驗(yàn)，僅僅是followprotocol把實(shí)驗(yàn)完成了，是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。一定得搞清楚原理是怎么回事，這樣出了問(wèn)題才知道怎么去改進(jìn)。MDABF1不僅僅給我以上的啟示。， 講述她的研究進(jìn)展。 其中她重點(diǎn)談到了MDABF1這個(gè)因子。 她實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在正在做的是試圖用蛋白質(zhì)純化的辦法來(lái)找出MDABF1的受體。她的測(cè)活方法是這樣的，首先表達(dá)MDABF1的重組蛋白，然后用同位素標(biāo)記，然后做bindingassay。這個(gè)bindingassay很麻煩，因?yàn)闆](méi)辦法用簡(jiǎn)單的手段把游離的MDABF1和與受體結(jié)合上的MDABF1分開(kāi)，只能用gelfiltrationcolumn來(lái)分開(kāi)，每做一次assay都很麻煩。，我個(gè)人覺(jué)得這個(gè)方法不是很明智。為什么呢?純化蛋白的過(guò)程中，各種膜蛋白都處于一種被去垢劑溶解的勻漿狀態(tài)，這種情況下，一些正常生理?xiàng)l件下不會(huì)與MDABF1結(jié)合的受體可能也會(huì)與其結(jié)合。 這樣一來(lái)，純化出來(lái)的東西就是亂七八糟的了。另外一種可能性是:有很多膜蛋白能與MDABF1相互作用， 但是只有一種膜蛋白能夠啟動(dòng)下游的信號(hào)傳導(dǎo)， 促進(jìn)Osteoblast的增長(zhǎng)。這種bindingassay的測(cè)活方法雖然可以找出與MDABF1結(jié)合得最好的膜蛋白，但是找出的膜蛋白可能根本沒(méi)有信號(hào)傳導(dǎo)的功能。需要強(qiáng)調(diào)的是，蛋白質(zhì)純化絕對(duì)不是萬(wàn)能的。要想純化出一個(gè)未知蛋白，最最重要的是要有一個(gè)簡(jiǎn)單明了直接的測(cè)活方法。實(shí)驗(yàn)的問(wèn)題，說(shuō)到底，就是沒(méi)有好的測(cè)活方法。這一個(gè)模塊的純化試驗(yàn)到此就為止了。我們測(cè)活之后，比較了各種去垢劑的純化效率，發(fā)現(xiàn)Triton,CHAPS,OctylGlucoside都還比較好，SodiumCholate則差好多。原始的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)上還有進(jìn)一步的insulinaffinitychromatography和其他分析。而教員為了滿足很多學(xué)生做做重組蛋白表達(dá)純化的愿望，用一些比較白癡的的實(shí)驗(yàn)取代了原有很經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)。比如一個(gè)實(shí)驗(yàn)是從SF9里面純化一個(gè)histag的蛋白amp。%$amp。$$!!!我知道要做這個(gè)試驗(yàn)之后，幾乎要抓狂了。我這一組其他幾個(gè)人還把這個(gè)試驗(yàn)當(dāng)寶，搶著做。而我最后選擇去跑了一個(gè)2Dgel。就這樣，第三個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)結(jié)束了。（二十）鈣調(diào)蛋白純化胰島素受體的模塊結(jié)束之后，我們這一組人進(jìn)入到最后一個(gè)模塊，做鈣調(diào)蛋白的純化和分析。鈣調(diào)蛋白(Calmodulin)十分重要，幾乎在所有真核細(xì)胞里面都能找到。這個(gè)蛋白只有148個(gè)氨基酸，大概16KD，比較小。有Ca2+結(jié)合的情況下，鈣調(diào)蛋白的構(gòu)象可以發(fā)生較大的改變，從而激活一系列酶的活性，比如cyclicnucleotidephosphodiesterase,一些proteinkinases,phosphatases和ATPase等等。這一個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)中，我們是從雞胗里面提取和純化鈣調(diào)蛋白，然后再做一些分析。這一個(gè)模塊的純化設(shè)計(jì)，可以說(shuō)是最大限度的利用了鈣調(diào)蛋白的特殊性質(zhì)，我覺(jué)得設(shè)計(jì)的很精彩。不過(guò)我對(duì)這個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷并不是很滿意。教員的實(shí)驗(yàn)助手只有一個(gè)人，而且非常不稱(chēng)職，對(duì)實(shí)驗(yàn)本身似乎不太了解，也不是很helpful，感覺(jué)比前幾個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)助手差多了。教員叫Constantin，是一個(gè)俄羅斯人，在rutgers當(dāng)教授。我起初對(duì)他印象不佳，后來(lái)發(fā)現(xiàn)這個(gè)人其實(shí)很nice,非常和藹?！　≌麄€(gè)純化步驟大概是這樣的。首先把雞胗剁碎勻漿，然后做粗分離，用硫酸銨沉淀的辦法把雜蛋白都沉淀下來(lái)。然后再做等電點(diǎn)沉淀，把Calmodulin沉淀下來(lái)。重溶沉淀之后再做透析來(lái)脫鹽。然后再過(guò)陰離子交換柱DEAESephadexA50。純化出來(lái)的組分再過(guò)疏水作用層析柱，就可以得到很純的Calmodulin了，用Commassieblue都可以染出來(lái)。我們做的實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有對(duì)Calmodulin的測(cè)活實(shí)驗(yàn)，可能是因?yàn)樽詈蠹兓鰜?lái)的Calmodulin很多,可以做光譜分析之類(lèi)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，所以就省掉了。但我多少有一點(diǎn)本末倒置的感覺(jué)。因?yàn)閷?duì)未知蛋白質(zhì)純化，首先就得有一個(gè)靠的住的測(cè)活方法,然后才能逐漸制定最優(yōu)化的純化策略。另外，在設(shè)計(jì)測(cè)活方法之前，還必須搞清楚，有生物活性的物質(zhì)是不是蛋白質(zhì)。一般有下列幾種方法。(1)對(duì)protease的是否敏感。(2)生物活性不會(huì)因?yàn)橥肝龆鴣G掉(3)Urea之類(lèi)的變性劑是否降低生物活性(4)對(duì)化學(xué)修飾劑(比如sulfurhydrylblockeridoacetamide)是否敏感。我們提取鈣調(diào)蛋白所用的組織原料，雞胗，量挺大的，有一斤之多，紅紅的一大堆