【正文】 blocker一般有下列幾種方法。但我多少有一點本末倒置的感覺。A50。然后再做等電點沉淀，把Calmodulin沉淀下來。教員叫Constantin，是一個俄羅斯人，在rutgers當(dāng)教授。這一個模塊的實驗中，我們是從雞胗里面提取和純化鈣調(diào)蛋白，然后再做一些分析。一些protein這個蛋白只有148個氨基酸，大概16KD，比較小。我這一組其他幾個人還把這個試驗當(dāng)寶，搶著做。%$amp。chromatography和其他分析。Cholate則差好多。,這種binding為什么呢?純化蛋白的過程中，各種膜蛋白都處于一種被去垢劑溶解的勻漿狀態(tài)，這種情況下，一些正常生理條件下不會與MDABF1結(jié)合的受體可能也會與其結(jié)合。很麻煩，因為沒辦法用簡單的手段把游離的MDABF1和與受體結(jié)合上的MDABF1分開，只能用gel她的測活方法是這樣的，首先表達(dá)MDABF1的重組蛋白，然后用同位素標(biāo)記，然后做bindingMDABF1不僅僅給我以上的啟示。所以呢，我感覺做實驗，僅僅是follow而游離的胰島素本身分子量很小，只有不到10KD，而且非常易溶，所以即使加了PEG，也沉淀不下來。PEG作為一種多元醇，可以想像為一種“分子海綿”，可以吸附水分子。receptor的測活方法而設(shè)計了一個方法,這個因子對Osteoblast（成骨細(xì)胞）的增長有促進作用。6000沉淀胰島素受體，而游離的胰島素不會被沉淀下來。然后加PEG（Poly（十九）MDABF1的啟示凝集素層析實際操作起來很簡單，跟過簡單的Ni柱子一樣?！《鳺GA主要識別GlcNAc和Sialic這種plexConA主要識別alphamannose,保留在ER或者CisGolgi的膜蛋白,Nglycan往往是HighmannoseMan代表Mannose甘露糖，而GlcNAc代表N乙酰葡萄糖胺.NXS/T　　　Man這個Nglycan加上去之后，并不是就大功告成了，而是要經(jīng)歷一系列“裁減”，有的糖基會被去掉，新的糖基又會被加上，這樣最后的NglycanNglycan是一個Oligosaccharide 結(jié)構(gòu)，好像一個分叉的樹枝一樣。如果膜蛋白有這個sequence,glycans 是哺乳動物細(xì)胞中最常見的一種糖基修飾。純化膜蛋白用的最主要的兩種凝集素是WGA和ConA。agarose或者ConAdomain和分泌蛋白都有Nlinkedreceptor。我們用去垢劑溶解了膜蛋白之后，緊跟著的一步就是用WheatX100，表達(dá)的Protein之所以很多實驗室之前都不成功，其中一個重要因素就是去垢劑。是一種膜蛋白，跟muscular我是做糖基轉(zhuǎn)移酶的。(8)選用的去垢劑是否影響所純化蛋白的活性？有些情況下，某些十分嬌貴的蛋白質(zhì)對一些去垢劑很敏感。我們在試驗中，先測了一下起始樣品的蛋白總濃度，然后以detergentpartitioning。X114是一種很特別的去垢劑，在室溫下很容易溶解在水中，但是在３０攝氏度以上會從水相中脫離出來，并且連帶的把膜蛋白也一起拽出來。去掉大量的可溶蛋白雜質(zhì)。receptor之類的膜蛋白,(5)是否需要用弱的去垢劑來去掉solubleagarose常常被用來純化具有Highmannose因為很多膜蛋白都有糖基修飾，凝集素層析可以利用這種性質(zhì)來純化一些膜蛋白?！　　∧z束分子量只有6KD,用透析就很容易去掉了。X100和NP40,assay方法。干擾比較嚴(yán)重，chaps,我們在實驗一開始專門做了測試，發(fā)現(xiàn)Tritonblue另外，有些去垢劑會嚴(yán)重的干擾一些protein我強烈建議大家以后選擇和使用去垢劑的時候先考慮以下幾個問題：(1)選擇的去垢劑是否干擾蛋白質(zhì)濃度的測定？如果用在蛋白質(zhì)純化里面，很有可能會破壞蛋白質(zhì)的活性。 Tritonglucoside,cholate)雖然脂類化合物也有類似性質(zhì)，但是去垢劑能夠形成膠束(micelle)，所以相比之下非常易于在水中溶解。好了，我先來講講去垢劑的小常識。和OctylX100,事實上，純化膜蛋白時去垢劑的選擇是沒有規(guī)律可循，除了一些顯而易見的不適和做純化的去垢劑(比如SDS)外，很難講什么去垢劑好什么去垢劑不好。（十七）何去何從上一章提到從大鼠肝臟提取質(zhì)膜的方法?！∏懊嫣岬竭^，質(zhì)膜相比其他膜結(jié)構(gòu)而言是比較輕的，所以呢，在離心的過程中就會浮到上層來。蔗糖的濃度十分的重要，如果不準(zhǔn)的話，根本就沒法分開。gradient)。然后就是用1500g離心了。勻漿用的緩沖液里面加有Ca2+，比較重要。 　　我們分離質(zhì)膜用的方法稍微特殊一點，省掉了差速離心這一步。membrane,需要強調(diào)的是，差速離心的分離是非常粗糙的，并不是十分干凈。拿上清再做第二次離心，這回離心力大了一個數(shù)量級，到了8000g。其實很簡單，就是用不同的速度離心三次。剩下的膜結(jié)構(gòu)比重比較相似，所以不好分。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)主要有核膜，質(zhì)膜，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，溶酶體等等。我覺得這種做法很不明智，因為重組蛋白純化的實驗實在不需要花幾千刀來冷泉港學(xué)的。事實上，手冊上這個實驗里面還得做一步insulin這位助手特別nice，給我?guī)椭艽?。Lin是一個好老師，喜歡在做實驗之前詳細(xì)給我們講解背景知識，這一 點上她比其他三位老師都做得好。胰島素受體即使溶解在去垢劑里面也能與胰島素接合，所以用簡單的bindingLin， 這一個模塊是從大鼠肝臟里面提取胰島素受體并且做一些鑒定。（十六）浮起來的細(xì)胞膜 好了，第二模塊的實驗，到這里就差不多了。這樣三分鐘三個樣品都完成了。孵育一分鐘,為什么呢？酶切一共有三步，間隔時間很短。之后呢就是做DNAse聚乙烯醇性質(zhì)就象一個分子海綿，占溶液體積不說，還跟蛋白質(zhì)搶奪水分子，所以加入這個東東之后呢，蛋白質(zhì)和探針的有效濃度都增大了，這樣有利于蛋白質(zhì)和探針的相互結(jié)合。footprinting有一種成分引起了我的注意，聚乙烯醇(polyvinyl首先是做同位素標(biāo)記探針的stock這樣我們可以知道那一部分沒有被切到。ladder一樣的東西。正是用來解決這個問題的。DNAase 我們在實驗中用了 第二種control,另一種對照呢，是看蛋白質(zhì)與探針的結(jié)合是不是與探針序列有關(guān)，因為如果是非特異性的結(jié)合，純化就沒有意義了。EMSA的陰性對照有兩種，一種呢，是用來看和探針的結(jié)合的蛋白是不是特異的某一種蛋白。生物實驗要想令人心服口服，沒有對照是不行的。我們做膠的時候，指導(dǎo)老師要我們把一塊玻璃板的貼著膠的一面硅化（用sigmacote,講，這個方法雖然很粗糙，但是比其他任何封底的辦法都管用。把兩大塊玻璃板和兩片spacer夾起來之后,然后拿去跑一個低濃度acrylamide膠。 　　　GelIcolumn分出來的組分，我們都測試了AP1的活性。純化步驟就只有這么多了。affinityoligo固定好，必須 得有不配對的overhang才行。amine來自于AGC三種堿基。 蛋白質(zhì)的primary蛋白質(zhì)或者核酸的伯胺基團(primaryCNBr活化是最常用的一個方法。AP1的純化呢，則是利用了轉(zhuǎn)錄因子與DNA序列的特異結(jié)合。需要動點腦筋的是一些利用特定蛋白質(zhì)特定性質(zhì)的親合層析。Chromatography)。Metal呵呵。這個學(xué)生有一天突發(fā)奇想，既然inhibitor可以與enzyme結(jié)合，為什么不能把inhibitorinteraction,　效率都很低。這個純化可是很麻煩的事情，用gel他主要貢獻是通過研究ribonuclease純化效率比別的層析方法可以高出一兩個數(shù)量級。affinity（十四）anfinsen的疑慮 　 　　跑完sephacryl柱子，組分就可以過DNA 　　忙活了半天，當(dāng)所有裝置都裝好的時候，感覺還是挺興奮的。第三個呢，是柱子是否裝的均勻。volume，知道這個空體積是很重要的。dextran)，藍(lán)色葡聚糖是帶有藍(lán)色染料的多糖高分子聚合體，體積非常大，所以在空體積(void 　　柱子裝好了，但還不能開始跑樣品。pump)液面低到靠近柱面的時候呢，就可以把上端液流接頭接到柱子上方。所以先加buffer是很必要的。洗完了，就把resin重懸成50%的slurry，然后就是往柱子里頭倒了。但是一個好處就是，樣品體積可以大一些。S300　上篇提到了Gel 一個是脫鹽，另一個是確定蛋白大小。filtration是肯定沒戲的。這種改進帶來的一個問題就是，需要用FPLC之類的設(shè)備提供較高的壓力,當(dāng)然，欣慰的是，該師妹最終沒有試gel她問我該怎么分開。filtration是很難把兩個蛋白完全分開的。column里面并不與柱材料相互結(jié)合，所以很容易擴散(diffusion)，擴散的結(jié)果就是蛋白峰非常寬。filtration帶來了一個嚴(yán)重的缺陷：低分辨率。filtration 這樣，蛋白質(zhì)分子可以根據(jù)大小而被gelfiltration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。filtration 這一步實驗是整個課程中第一次跑凝膠過濾色譜(gelfiltration的先天缺陷 上一篇講到核提取物。S300H1，可以抑制體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。核膜，染色質(zhì)之類的垃圾不能溶解，轉(zhuǎn)錄因子之類的蛋白卻能溶解。話扯遠(yuǎn)了，現(xiàn)在再回到AP1purification。比如lysosome把，比重和線粒體及過氧化酶體很相近。 　　現(xiàn)在想起來，細(xì)胞器官的分離，幾乎無一例外都是利用細(xì)胞器比重不一樣來分離 的。Golgi之類的東東都漏出來了。讓細(xì)胞核不至于在破 碎細(xì)胞的時候就破裂。KCl沒有什么好說的， 可以換成NaCl。KCl這個時候呢，把重懸的細(xì)胞用Dounce一升media的Hela細(xì)胞才要１７刀。 　　核抽提物是怎么準(zhǔn)備的呢？首先，融解Hela細(xì)胞。（十一）核抽提物 上回談到純化AP1轉(zhuǎn)錄因子的大致流程。Oligos會被降解掉！另外一個原因是，核提取物有一些可以和DNA非特異結(jié)合的蛋白，這些蛋白會飽和DNA這樣一來，為什么要自找麻 煩做這又貴又麻煩的一步呢？原因在于這一步可以去掉核提取物里面的核酸酶，所以如果直接跑DNA高度40cm）。S300到了這一步，AP1可以占到蛋白量的 10~50%。然后粗分的產(chǎn)物再跑一下凝膠過濾層析，比活力再提高到初始產(chǎn)物的5到10倍。 　整個純化過程是這樣的：首先制備Hela細(xì)胞的核提取物，然后用硫酸氨沉淀的辦法粗分一下組分，小分子量蛋白(比如Histone這個模塊涉及的一些實驗是最經(jīng)典的一些分離轉(zhuǎn)錄因子的方法，所以很有用。Zipper的結(jié)構(gòu)，而helix另一邊就是堿性的氨基酸居多，所以可以和DNA 結(jié)合。dimer。AP1是一種很重要的sequence永遠(yuǎn)的轉(zhuǎn)錄因子 　　　 　第一個模塊的實驗結(jié)束以后，我們進入第二個模塊的實驗。50%到60%,60%,把樣品分成五份，每份分別加硫酸氨至20%,Dr.albumin濃度是非常高的了，這樣一分，大大提高了后續(xù)純化步驟的效率。但是其實可以用一個低一點的濃度，只把serum里 頭把抗體給純化出來。Burgess講過一個例子。在低鹽濃度下，如果增加鹽濃度，會增強蛋白質(zhì)的溶解，這是因為，鹽的離子與蛋白質(zhì)表面的正負(fù)電荷配對，減少了蛋白質(zhì)電荷表面相互作用的機會。TCA是個強酸，施放出 來的質(zhì)子中和了蛋白質(zhì)的負(fù)電荷，只留下正電荷與TCA形成不溶物，從而變性。這種方法對大量樣品尤其好 用，因為比較方便快捷便宜。但其實這種沉淀是蛋白質(zhì)純化中及其重要的一種方法。polymerase的各個亞基。免疫親合柱就沒有什么好說的了。到了這一步，還有一個問題。polymerase和DNA是結(jié)合的，所以PEI沉淀DNA的同時，把RNA這個東東我過去沒碰到，所以很感興趣。但是為了提高純化的效果，Burgess要我們提前用PEI沉淀的辦法來粗分一下。RNA Sigma32在大腸桿菌過表達(dá)的時候，絕大部分都是inclusion再加上sigma32 很奇怪，既有負(fù)電的表面，又有帶正電的表面，所以可以用陽離子交換柱。為什么這一次用Poros我們接著試了用sarkosyl做 變性劑的蛋白重折疊。Stillman實驗室正在準(zhǔn)備一篇文章要投到nature上去?？赡茏孋DC6更穩(wěn)定。有GST的CDC6是可溶的，可是一旦把GST切掉了，CDC就沉淀出來了....%^amp。tag,這下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是還是沒有活性。然后他們嘗試用大腸桿菌來表達(dá)。 　StillmanproteinReplicationass。用他的話說，是a他主要研究真核生物的DNA復(fù)制。是冷泉港的現(xiàn)任主管，是一個絕對的牛人。41:Protein這種flask的瓶底邊緣有幾處凹陷(類似于可樂塑料瓶底那樣的形狀)，能有效增加空氣培養(yǎng)基的混合。大腸桿菌的密度可以從一般的OD600 　最后Bill和有意思的是，細(xì)菌有一種很有意思的特點，如果培養(yǎng)基里有足量的glucose，細(xì)菌會優(yōu)先攝取glucose,而不能攝取lactose。有乳糖(lactose)，tryptone里面也有乳糖的污染。原來我們一般用的LB我來來回回一共轉(zhuǎn)化了五六次，最后終于找到了唯一的一個菌落。 這一點我深有體會。這個系統(tǒng)非常強大，原因 在于T7來誘導(dǎo)T7RNA識別，而這個咚咚大腸桿菌是沒有的。T7 T7polymeraseNational　晚上每天都有人做報告，我覺得讓我收獲最大的是Bill實驗結(jié)果出來后，看著我們驚訝的表情，Burgess臉上都笑開花了，呵呵。glycerol。reader，我們可以實時監(jiān)控折疊的效果。TGE+45%TGE+15%試劑盒，內(nèi)有十幾種不