【正文】 idoacetamide)是否敏感。hydryl(1)對(duì)protease的是否敏感。另外，在設(shè)計(jì)測(cè)活方法之前，還必須搞清楚，有生物活性的物質(zhì)是不是蛋白質(zhì)。因?yàn)閷?duì)未知蛋白質(zhì)純化，首先就得有一個(gè)靠的住的測(cè)活方法,我們做的實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有對(duì)Calmodulin的測(cè)活實(shí)驗(yàn)，可能是因?yàn)樽詈蠹兓鰜?lái)的Calmodulin很多,可以做光譜分析之類(lèi)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，所以就省掉了。純化出來(lái)的組分再過(guò)疏水作用層析柱，就可以得到很純的Calmodulin了，用CommassieSephadex重溶沉淀之后再做透析來(lái)脫鹽。首先把雞胗剁碎勻漿，然后做粗分離，用硫酸銨沉淀的辦法把雜蛋白都沉淀下來(lái)。我起初對(duì)他印象不佳，后來(lái)發(fā)現(xiàn)這個(gè)人其實(shí)很nice,非常和藹。教員的實(shí)驗(yàn)助手只有一個(gè)人，而且非常不稱(chēng)職，對(duì)實(shí)驗(yàn)本身似乎不太了解，也不是很helpful，感覺(jué)比前幾個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)助手差多了。這一個(gè)模塊的純化設(shè)計(jì)，可以說(shuō)是最大限度的利用了鈣調(diào)蛋白的特殊性質(zhì)，我覺(jué)得設(shè)計(jì)的很精彩。和ATPase等等。kinases,phosphodiesterase,有Ca2+結(jié)合的情況下，鈣調(diào)蛋白的構(gòu)象可以發(fā)生較大的改變，從而激活一系列酶的活性，比如cyclic鈣調(diào)蛋白(Calmodulin)十分重要，幾乎在所有真核細(xì)胞里面都能找到。（二十）鈣調(diào)蛋白就這樣，第三個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)結(jié)束了。而我最后選擇去跑了一個(gè)2D我知道要做這個(gè)試驗(yàn)之后，幾乎要抓狂了。$$!!!tag的蛋白amp。而教員為了滿足很多學(xué)生做做重組蛋白表達(dá)純化的愿望，用一些比較白癡的的實(shí)驗(yàn)取代了原有很經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)。affinityGlucoside都還比較好，SodiumCHAPS,我們測(cè)活之后，比較了各種去垢劑的純化效率，發(fā)現(xiàn)Triton實(shí)驗(yàn)的問(wèn)題，說(shuō)到底，就是沒(méi)有好的測(cè)活方法。要想純化出一個(gè)未知蛋白，最最重要的是要有一個(gè)簡(jiǎn)單明了直接的測(cè)活方法。assay的測(cè)活方法雖然可以找出與MDABF1結(jié)合得最好的膜蛋白，但是找出的膜蛋白可能根本沒(méi)有信號(hào)傳導(dǎo)的功能。有很多膜蛋白能與MDABF1相互作用， 但是只有一種膜蛋白能夠啟動(dòng)下游的信號(hào)傳導(dǎo)， 促進(jìn)Osteoblast的增長(zhǎng)。 這樣一來(lái)，純化出來(lái)的東西就是亂七八糟的了。我個(gè)人覺(jué)得這個(gè)方法不是很明智。filtrationassayassay。 她實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在正在做的是試圖用蛋白質(zhì)純化的辦法來(lái)找出MDABF1的受體。 講述她的研究進(jìn)展。protocol把實(shí)驗(yàn)完成了，是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。聽(tīng)完這個(gè)小插曲，我感覺(jué)挺吃驚，作為一個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的教授，而Dr.receptor可以被沉淀下來(lái)的原因。這樣樣品中蛋白的有效濃度實(shí)際變大了好多，容易出現(xiàn)聚集然后沉淀的現(xiàn)象。問(wèn)題出在PEG沉淀這一步。其中連PEG沉淀都是一樣的。所以她就比照insulin 然后呢，她就想把這個(gè)因子的受體給找出來(lái)。MDABF1。說(shuō)到PEG沉淀。)ethylene具體的測(cè)活步驟非常簡(jiǎn)單，就是把I125標(biāo)記的胰島素和純化的組分混合然后孵育一段時(shí)間。拿到洗脫的蛋白之后，我們就著手開(kāi)始測(cè)活，分析純化的效率和倍數(shù)。最后需要指出來(lái)是，純化一種特定蛋白，選擇用什么凝集素是完全經(jīng)驗(yàn)性的，需要提前測(cè)試才知道的。acids，所以特別適合于純化這種類(lèi)型的蛋白，洗脫液可以用GlcNAc和Sialicacid（唾液酸，一種帶負(fù)電的糖）和GlcNAc。typetype。alphaglucose和alphaGlcNAc,所以可以這三種糖溶液來(lái)做洗脫液。最適合于純化這種蛋白的凝集素是ConA。type。|||/\Manstructure往往是千奇百怪。core。膜蛋白的新生肽鏈在被翻譯合成的同時(shí)會(huì)被直接塞入ER最前面的Asparagine多半被Nglycan修飾。NXS/T上面。 這種糖基是加在膜蛋白的extracellularNlinked談到這里，我先向大家介紹一下Nlinked但盡管如此，凝集素層析是一種很好的辦法，因?yàn)閎uffer條件非常溫和，洗脫液是加了糖的buffer，透析什么的也方便，非常非常適合于和其他層析方法偶連起來(lái)用。agarose可以部分提純膜蛋白。根據(jù)這個(gè)性質(zhì)，用固定有適當(dāng)?shù)哪氐腷eads，比如WGAglycan絕大部分膜蛋白的extracellularWGA是凝集素(Lectin）中的一種，而Lectin指的是可以與糖基結(jié)合的蛋白質(zhì)。agarose來(lái)部分純化insulinGerm（十八）凝集素層析Omannosyltransferase完全沒(méi)有活性，相比之下用了Octyl這個(gè)成功的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，如果用常規(guī)濃度下的TritonTriton一直到前兩年，終于有一個(gè)實(shí)驗(yàn)室證明了這個(gè)蛋白是有活性的。dystrophy有關(guān)系，是一個(gè)研究熱點(diǎn)。1有一種酶叫Protein我舉一個(gè)例子。問(wèn)題是,很難預(yù)先就知道那種去垢劑會(huì)降低蛋白活性。5:1的比例加去垢劑。:(7)去垢劑的用量是否足夠?要充分的溶解膜蛋白，去垢劑的用量必須足夠才行。我并不太喜歡這種方法，因?yàn)橛幸唤M人做了這個(gè)實(shí)驗(yàn)，感覺(jué)分得并不是那么干凈，在可溶相還是有不少insulinphase這樣呢，就可以把膜蛋白和可溶蛋白分開(kāi)。partitioning？Triton(6)是否需要用去垢劑來(lái)做Twoprep,但是可是用來(lái)處理plasmacholate是一種很弱的去垢劑，雖然不能用來(lái)很有效的溶解insulinprotein?有時(shí)候用去垢劑并非完全是用來(lái)溶解膜蛋百，其實(shí)也可以用來(lái)去掉一些可溶蛋白雜質(zhì)。glucoside的親水基團(tuán)是一個(gè)glucose。type　Nglycan的蛋白質(zhì)，與mannose和glucose都能結(jié)合。比如ConA類(lèi)似與Octyl選用的去垢劑是否構(gòu)成干擾？凝集素是一種植物中提取的一系列可以與糖基結(jié)合的蛋白。另外，由于去垢劑有疏水基團(tuán)，一般用了去垢劑之后，就不應(yīng)該在后續(xù)步驟里采用疏水作用層析的方法了。(3)是否需要在以后的步驟里面用到離子交換層析或者疏水作用層析？離子型去垢劑會(huì)與相應(yīng)離子交換柱結(jié)合得很好，干擾蛋白質(zhì)的純化。相比之下CHAPS單體分子量615,聚集數(shù)是10,單體分子量是628,膠束的單體聚集數(shù)是140,比如大家常用的Triton(2)是否需要在以后的步驟里面去掉或者置換掉去垢劑？去掉或者置換掉去垢劑是一件很麻煩的事情。遇到這種干擾問(wèn)題，要么換去垢劑，要么換protein尤其是OctylassayX100和sodium所以可以想見(jiàn)，這種染料不單能染蛋白質(zhì)，也能染一些去垢劑。G250染料。assay，用的是massieassay。而相比之下CHAPS和膽酸鈉之類(lèi)的去垢劑就沒(méi)有這個(gè)問(wèn)題。類(lèi)似于Triton選擇適當(dāng)去垢劑來(lái)純化膜蛋白，有一些實(shí)際問(wèn)題必須先想好。所以一般商業(yè)化的,比較純的NP40和Triton我想強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，聚乙氧乙醇基團(tuán)與氧氣很容易發(fā)生反應(yīng)形成過(guò)氧化物,X100和NP40大家都用得比較多。X100和NP40。(4)聚乙氧乙醇基團(tuán),(3)糖類(lèi)衍生物,比如Octyl(2)兩性離子基團(tuán),去垢劑的親水基團(tuán)一般有(1)羧酸基團(tuán)，比如膽酸鈉(sodium去垢劑的疏水基團(tuán)一般是下面三種(1)直鏈或者支鏈烷基結(jié)構(gòu)(2)類(lèi)固醇之類(lèi)的多元環(huán)結(jié)構(gòu)(3)取代苯基結(jié)構(gòu)(比如大家常用的Triton首先，什么是去垢劑(detergent)呢？就是同時(shí)具有疏水和親水兩種基團(tuán)的化合物。去垢劑其實(shí)是很大一門(mén)學(xué)問(wèn)，我?guī)啄昵熬突ㄟ^(guò)好多力氣來(lái)學(xué)習(xí)其中的一些知識(shí)，但到現(xiàn)在為止還是只懂了一些皮毛。Glucoside。glucoside。Chaps,SodiumTriton所以，只能具體問(wèn)題具體分析，一個(gè)一個(gè)去嘗試。選擇去垢劑很簡(jiǎn)單，無(wú)非是想讓膜蛋白能被充分的溶解解離下來(lái)，同時(shí)又不使蛋白變性。質(zhì)膜準(zhǔn)備好了，下一步就得考慮怎么溶解質(zhì)膜。到這里質(zhì)膜的分離就算完成了。我們吃罷午飯，就回來(lái)看離心管，果然看到一層棕色的東西浮在最上面。下一步呢，就是把加了蔗糖的勻漿轉(zhuǎn)移到超速離心管里，%的蔗糖溶液，接著就是超速離心兩小時(shí)（九萬(wàn)g）。我們有一個(gè)折射儀，可以很快的測(cè)出溶液的折射率以及對(duì)應(yīng)的蔗糖濃度。勻漿里面加69%的蔗糖溶液，一直到終濃度變?yōu)?4%為止。蔗糖梯度離心是十分古老的一種方法，但直到現(xiàn)在還有很廣泛的應(yīng)用。下面就開(kāi)始準(zhǔn)備蔗糖梯度離心(sucrose拿出離心管一看，果然有一個(gè)很松的pellet，包括了質(zhì)膜，細(xì)胞核之類(lèi)的東西。cloth過(guò)濾，去掉了很多結(jié)締組織。鈣離子能夠促進(jìn)質(zhì)膜碎片的聚集，這樣在1500g這樣小的離心力下，質(zhì)膜也能被沉淀下來(lái)。弄碎了之后就加一種低滲緩沖液，再把碎的肝臟和緩沖液倒到Dounce勻漿器里面做勻漿。這種方法對(duì)于分離 大鼠肝臟質(zhì)膜比較管用，對(duì)別的組織就不一定好用了。nucleotidase　的活性)來(lái)分析分離方法的好壞，并加以改進(jìn)。測(cè)539。最好的辦法是利用細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)特征性的一些標(biāo)記物（比如plasma下一步的蔗糖梯度離心就要精細(xì)得多。所有的膜結(jié)構(gòu)都會(huì)在此時(shí)沉淀下來(lái)，所以也包括質(zhì)膜。由于線粒體比其它膜結(jié)構(gòu)要重一些，所以線粒體沉淀下來(lái)，而其它膜結(jié)構(gòu)還在上清里面。細(xì)胞主要的膜結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞質(zhì)都還在上清里面。首先用等滲緩沖夜來(lái)做組織的勻漿，然后就開(kāi)始離心。centrifugation）是粗分膜結(jié)構(gòu)的 一種常用方法。 　　膜結(jié)構(gòu)分離的方法呢，有很多種，但是變來(lái)變?nèi)?，無(wú)非都是兩種基本方法的組合： 差速離心+蔗糖梯度離心。這兩種膜結(jié)構(gòu)也是很好分開(kāi)的。其中核膜是最容易的，因?yàn)榧?xì)胞核很重，稍微離心一下，就沉淀下來(lái)了。Enzymology有專(zhuān)門(mén)的一輯 整本都是講這個(gè)的。 　　細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的分離是一門(mén)大學(xué)問(wèn)，著名的Methods但是最近好多年，很多學(xué)員更希望做一些重組蛋白純化的實(shí)驗(yàn)，所以就把原來(lái)的實(shí)驗(yàn)給切短了。affinity大家可能注意到，最后純化出來(lái)的受體只是粗產(chǎn)品。 　　好了，現(xiàn)在聊一聊純化的實(shí)驗(yàn)步驟。professor。另外她的助手是一位臺(tái)灣的中年婦女，在SueHwa 實(shí)驗(yàn)室做research 　　SueHwaassay就可以測(cè)活了。受體蛋白純化尤其麻煩，往往可能找不到又快又準(zhǔn)確的測(cè)活辦法。四個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)之中，我最喜歡這個(gè)模塊。老師是SueHwa　　休息了一整天，晚上全體學(xué)員和老師去一家sushi店飽餐了一頓生魚(yú)片。我學(xué)校離CSH很近，索性晚上就溜回去了，順便還把YL硬拉出來(lái)聽(tīng)我匯報(bào)學(xué)習(xí)心得，呵呵。這個(gè)培訓(xùn)課兩星期的課程也進(jìn)行了一 半。最后看結(jié)果的時(shí)候，我還特緊張，因?yàn)檫@是很重要的一份試驗(yàn)數(shù)據(jù)，最后結(jié)果很不 錯(cuò)，還受了老師表?yè)P(yáng)，呵呵。丹麥女孩計(jì)時(shí)，然后我加樣品。每20秒加一個(gè)樣品,第三步是加反應(yīng)中止液。I第一步是加Ca2+和Mg2+孵育一分鐘,我們這一組里，我和丹麥女生負(fù)責(zé)做酶切，這個(gè)酶切可是把我們忙壞了。Isolution配好之后，就是加我們純化出來(lái)的組分，孵育十幾分鐘。聚乙烯醇的作用原理跟PEG很相似，第三個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)里面會(huì)用到PEG沉淀。足跡實(shí)驗(yàn)最關(guān)鍵的就是要保證樣品蛋白和探針有充分的結(jié)合。assayIalcohol)。solution里面除了探針以外，還加了非特異DNA,類(lèi)似于poly(dIdC) poly(dAdT)之類(lèi)的東西。solution。的用量和酶切時(shí)間。這個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟其實(shí)不復(fù)雜，但是有些tricky，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是DNase就會(huì)空缺一部分。但是，如果有蛋白與特定區(qū)域相結(jié)合，DNase可以隨機(jī)的分解DNA，正常情況下，一段DNA探針各處被酶切的可能性大致相當(dāng)，如果跑膠再做放射自顯影的話，看到的會(huì)是DNADNaseassayIassay雖然能夠證明一段Oligos是否能和蛋白質(zhì)結(jié)合，卻還是不 能告訴我們?cè)摰鞍踪|(zhì)到底與哪一小段的序列直接接觸。Gel效果挺驚人，僅僅是兩個(gè)nucleotide和探針不一樣，競(jìng)爭(zhēng)DNA探針就沒(méi) 法work了。interaction， 一兩個(gè)nucleotide不一樣就無(wú)法削弱的話， 說(shuō)明看到的探針與蛋白質(zhì)的結(jié)合是跟探針序列緊密相關(guān)的。這種對(duì)照也很簡(jiǎn)單，在蛋白質(zhì)與探針?lè)跤耐瑫r(shí)，加入沒(méi)有同位素標(biāo)記的探針來(lái)競(jìng)爭(zhēng)。這叫supershift。做法很簡(jiǎn)單，就是蛋白質(zhì)和探針?lè)跤耐瑫r(shí)加入抗那種蛋白的抗體，抗體識(shí)別蛋白質(zhì)之后會(huì)形成更大的protein關(guān)鍵是陰性對(duì)照，來(lái)看蛋白質(zhì)與探針的結(jié)合是否特異。EMSA也不例外。這樣打開(kāi)膠夾層的時(shí)候,膠只會(huì)緊緊貼在一面玻璃上面，把膠和這整塊玻璃拿去放射自顯影就行了。成分是氯化有機(jī)硅氧烷)跑完如果把一塊玻璃板從膠上拿開(kāi)的話，膠的某些部分會(huì)分別粘在兩個(gè)玻璃板上，這樣取膠的時(shí)候就很容易把整個(gè)膠弄破。還有一個(gè)小竅門(mén)。這是一個(gè)小竅門(mén)，據(jù)instructorinstructor先做一個(gè)gel跑膠的裝置塊頭挺大的，是用來(lái)跑DNA測(cè)序膠的裝置。如果探針結(jié)合上蛋白了，速度會(huì)變慢很多，就會(huì)停滯在膠的上段；如果沒(méi)有結(jié)合上，探針就會(huì)自由的跑到膠的下段去。原理很簡(jiǎn)單，把蛋白質(zhì)樣品和P32標(biāo)記的寡聚核苷酸探針 一起孵育十幾分鐘,Mobilityshift我過(guò)去沒(méi)做過(guò)這兩種實(shí)驗(yàn)，所以感覺(jué)很新奇，做的也格外賣(mài) 力，結(jié)果也還不錯(cuò)。footprinting(DNase方法呢就只有兩種，一種是凝膠遷移率變動(dòng)分析(EMSA)，另一種是DNA水解酶Iaffinity剩下的就是一些活性測(cè)定。6預(yù)裝柱子。chromatography之后我們又跑了一個(gè)更精細(xì)的 Gel　　　第二個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)，DNA?。ㄊ澹〢P1的活性測(cè)定 了解一些基本的偶連方法的化學(xué)原理是很有用的。這是一個(gè)小竅門(mén)，但是給我們的一個(gè)啟示是，要做好affinity所以呢，要想把DNADNA是雙鏈互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)，堿基上的primaryDNA的primaryamine主要來(lái)自于lysine,NH2) 與其發(fā)生反應(yīng)， 形成共價(jià)鍵聯(lián)在beads上。aminecarbonate的中間產(chǎn)物,原理很簡(jiǎn)單，CNBr的碳