【正文】 。 ? （ 2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有： 去污劑、 Triton X100、十二烷基硫酸鈉（ SDS）和 N的 NaOH。 ? （ 3）干擾物質(zhì)少。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。 在 595nm下測(cè)定的吸光度值 A595， 與蛋白質(zhì)濃度成正比 ?？捡R斯亮蘭 G250染料，在 酸性溶液 中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料最大吸收峰的位置由 465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由 棕黑色變?yōu)樘m色 。利用一定波長(zhǎng)下， 蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系 ，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同 蛋白質(zhì)的紫外吸收 ? 蛋白質(zhì)分子中， 酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸 殘基的苯環(huán)含有 共軛雙鍵 ，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。 特 點(diǎn) ? 此法操作 簡(jiǎn)便，靈敏度比雙縮脲法高 100 倍 ，定量范圍為 5～ 100μg蛋白質(zhì)。 Folin酚反應(yīng) ? Folin酚試劑法包括 兩步反應(yīng) ： 第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì) 中的 肽鍵與銅 作用生成 蛋白質(zhì) 銅絡(luò)合物 ；第二步是此絡(luò)合物將 磷鉬酸 磷鎢酸試劑（ Folin 試劑）還原，產(chǎn)生深藍(lán)色 （磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物）， 顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，比色法確定蛋白質(zhì)含量。 雙縮脲反應(yīng) ? 原理： 在堿性溶液中，蛋白質(zhì)因含有兩個(gè)以上的肽鍵， 可 與 Cu2+形成 紫紅色絡(luò)合物 ， 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比 ，因此可利用 比色測(cè)定 蛋白質(zhì)含量。 ? 消化后，在凱氏定氮儀中加入 強(qiáng)堿 堿化消化液，使硫酸銨分解，放出氨 。當(dāng)天然含氮有機(jī)物與 濃硫酸 共熱，分解出 碳、氫、氮形成二氧化碳、水及氨 ，產(chǎn)生的氨能夠與 硫酸 結(jié)合，生成硫酸銨，此過程稱為 “消化” 。其實(shí)，真實(shí)分子量是最小分子量的 n倍， n指 Fe的數(shù)目， Mb的 n=1，所以M=16700； 而 Hb用其他方法測(cè)得分子量為 68000，則說 Hb含 4個(gè)Fe原子。 蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 最小分子量測(cè)定法： 如 Mb含 Fe為 %，則 M=。 溶解度恒定法 加入樣品量為橫坐標(biāo)，樣品溶解量為縱坐標(biāo)，作 圖。 ? 超速： 50000120220rpm 蛋白質(zhì)純度的鑒定 各種細(xì)分級(jí)的方法都可以用于純度鑒定 常用各種電泳法 ，比較權(quán)威的有：等速電泳、梯度電泳、等電聚焦電泳、 聚丙烯酰胺凝膠電泳。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于顆粒的密度時(shí)，顆粒上??；當(dāng)管頂介質(zhì)的密度小于顆粒的密度時(shí)，則顆粒沉降； 最后顆粒進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置，顆粒不再移動(dòng)，形成穩(wěn)定的區(qū)帶。 蔗糖密度梯度離心 等密度離心法 ? 某些密度梯度介質(zhì)經(jīng)過離心后會(huì)自身形成梯度，如細(xì)胞分離液 Percoll。沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈的區(qū)帶也越低。 速度區(qū)帶離心法 ? 在 離心前離心管內(nèi)預(yù)先裝入密度梯度介質(zhì) (如蔗糖、甘油、 KBr、 CsCl等 )，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部或梯度層中間，同梯度液一起離心。密度梯度離心法包括 速度區(qū)帶 和 等密度離心 二種方法。 主要用于分離細(xì)胞器和病毒。 如：離心管口 R＝ ，管底 R＝ ， rpm＝ 12022 離心機(jī)的分類 ? 目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常用的離心機(jī)種類很多，按其 離心轉(zhuǎn)子能達(dá)到最高轉(zhuǎn)速 分： ? 低速離心機(jī) (在 6,000 rpm以下 ) ? 高速離心機(jī) (在 25,000 rpm以下 ) ? 超速離心機(jī) (在 30,000 rpm以上 ) 離心分離技術(shù)的種類 ? 差速離心法是指通過不斷 增加相對(duì)離心力 ，使沉降速度不同的顆粒，在不同離心速度及不同離心時(shí)間下分批離心方法。計(jì)算顆粒的相對(duì)離心力時(shí)，應(yīng)注意離心管與旋轉(zhuǎn)中心的 距離 R。 相對(duì)離心力 ? 相對(duì)離心力 (RCF)是 指在離心力場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球引力的倍數(shù) 。沉降系數(shù)的單位用 Svedberg表示，單位為 秒 ， 1 Svedberg＝ 1013秒 ， 簡(jiǎn)稱 S。 沉降系數(shù) ? 沉降系數(shù)為顆粒在 單位離心力場(chǎng)作用下的沉降速度 ，是 1924年 Svedberg提出的。每個(gè)顆粒都有一定 大小、形狀、密度和質(zhì)量 。離心機(jī)的種類繁多，用途各異。 常用的軟件如安瑪西亞公司的 Image Master 2D Elite或 Image Master 2D Planium分析軟件。 常用的軟件如安瑪西亞公司的 Image Master 2D Elite或 Image Master 2D Planium分析軟件 。商品化的IPG strips可以從 Amersham Pharmacia公司或 BioRad公司購(gòu)買。這兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合形成的二維電泳是分離分析蛋白質(zhì)最有效的一種電泳手段。 雙向凝膠電泳 ? 雙向凝膠電泳是一種由 任意兩個(gè)單向凝膠電泳 組合而成的，即在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進(jìn)行第二向電泳。 固相化 pH梯度凝膠 (IPG)的優(yōu)點(diǎn) ? 避免陰極漂移： 因 pH梯度是 共價(jià)固定 于凝膠內(nèi)部的，具有更寬的 pH分離范圍，使過酸過堿的蛋白質(zhì)得到分離 ? 具有更高的負(fù)載蛋白質(zhì)的能力 ? 生產(chǎn)上重復(fù)性好 雙向電泳 (twodimensional electrophoresis, 2DE) ? 最早是由 Smithies和 Poulik提出，蛋白質(zhì)第一向根據(jù)其 自由遷移率， 在 濾紙條 上進(jìn)行的；第二向電泳方向與第一向垂直，在 淀粉膠 上進(jìn)行。 IEFE的改進(jìn) ? 1982年， Bjellqvist等提出了 固相化 pH梯度（ immobilized pH gradients, IPG） ? 方法： 通過在灌膠時(shí)將丙烯酰胺緩沖液中加到聚丙烯酰胺凝膠中來產(chǎn)生 pH梯度。過酸過堿的蛋白質(zhì)較難分離。在生產(chǎn)加工方面， 不同批次之間產(chǎn)品有很大變化，影響分離的重復(fù)性 。 ? 理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在 pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo) ，保證 pH梯度的穩(wěn)定和允許一定的電流通過。 載體兩性電解質(zhì)（ ampholyte，商品名為 ampholine） ? 早期的 IFE方法用的是 載體兩性電解質(zhì) pH梯度聚丙烯酰胺管狀膠 。 其次一些低 pI的載體兩性電解質(zhì)分子 （ 負(fù)電荷比較多的 ） 也將向陽極移動(dòng) ， 直到它的凈電荷被減少到零才停止 。 沒通電時(shí)的變化 引入電場(chǎng)時(shí)的變化 載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移 ， 等電點(diǎn)最低的分子 （ 負(fù)電荷最多的 ）將最快地向陽極遷移 。 pH范圍： pH3~10 pH梯度的形成 載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物 ， 在通電后 ， 它們各自遷移到適當(dāng)位置形成一個(gè)連續(xù)的 pH梯度 。 原 理 ? 等電聚焦 就是在電泳介質(zhì)中放入 載體兩性電解質(zhì) ，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽極到陰極逐步增加的 pH梯度 ，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于其相當(dāng)