蛋白質(zhì)分離純化步驟(參考版)
2024-11-19 04:00本頁面
【正文】 大多數(shù)蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞中都是和核酸等生物分子結(jié)合在一起，而且每種類型的細(xì)胞都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)（2）由于有機(jī)溶劑會使蛋白質(zhì)變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機(jī)溶劑濃度（3）由于有機(jī)溶劑會使蛋白質(zhì)變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機(jī)溶劑濃度。 內(nèi)容總結(jié)（1）一、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。由于有機(jī)溶劑會使蛋白質(zhì)變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機(jī)溶劑濃度。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，進(jìn)而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質(zhì)。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。常用的有下列幾種方法： 1. 等電點沉淀法 不同蛋白質(zhì)的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分離?！ 。ㄈ┑鞍踪|(zhì)粗制品的獲得 選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX100等），使膜結(jié)構(gòu)破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離?！ ?二) 蛋白質(zhì)的抽提 通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。4. 超聲波法 使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。3. 反復(fù)凍融法 生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。常用設(shè)備有，高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)大約在110—13～20010—13s范圍內(nèi)，即1S～200S。國際上采用Svedberg單位作為沉降系數(shù)的單位，用S表示，以紀(jì)念超速離心法的創(chuàng)始人。蛋白質(zhì)溶液在受到強(qiáng)大的離心力作用時，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質(zhì)分子的大小、密度和分子形狀有關(guān)，也與溶劑的密度和粘度有關(guān)。（三）沉降法以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)和其相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣，消除了蛋白質(zhì)之間原有的電荷和形狀的差異，電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS（％）后，SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負(fù)電荷，這些電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原來所帶的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異。而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中加入了十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）。（二）SDS聚丙
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