【正文】 純化工作一直要進(jìn)行到這個(gè)比活不再增加為止 ? * 酶活性單位 定義為在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下催化產(chǎn)生 1mol產(chǎn)物 /min所需的酶量。 （ 6）酶的純度的鑒定 ? 純化程度： 通常用這一特定成分的含量(一般用活力單位 )與總蛋白量（重量單位）之比來表示。純蛋白質(zhì)樣品在 HPLC的洗脫圖譜上呈現(xiàn)出單一的對(duì)稱峰。純的蛋白質(zhì)在一系列不同的pH條件下進(jìn)行電泳時(shí)，都將以單一的速度移動(dòng)，它的電泳圖譜只呈現(xiàn)一個(gè)條帶 (或峰 )。因此， 利用抗體 —抗原反應(yīng) ，也可以測(cè)定某一特定蛋白質(zhì)的含量。 ? 具有酶或激素性質(zhì)的蛋白質(zhì)可以利用它們的 酶活性或激素活性 來測(cè)定含量。 6. 膠體金測(cè)定法 ? 膠體金 是一種帶負(fù)電荷的疏水膠體，呈洋紅色，遇蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，顏色改變與蛋白質(zhì)有定量關(guān)系，是幾種方法中靈敏度最高的，檢測(cè)量是 ng水平。 ? 本方法可允許的測(cè)定范圍是 2—20ug蛋白質(zhì)。 ? 考馬斯亮藍(lán) R250和蛋白質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合 ， 呈藍(lán)色 ， 在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi) ， 蛋白質(zhì)的染色符合比爾定律 。在此基礎(chǔ)上，發(fā)展蛋白質(zhì)染色測(cè)定方法。 ? 缺點(diǎn)： ? (1) 對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì) ， 有一定的誤差 ， ? (2) 若樣品中含有嘌呤 、 嘧啶等吸收紫外線的物質(zhì) ， 會(huì)出現(xiàn)較大的干擾 。 紫外吸收法的優(yōu)缺點(diǎn)： ? 優(yōu)點(diǎn)： 簡便 、 不消耗樣品 ， 低濃度鹽類不干擾測(cè)定 。 4. 紫外吸收法 ? 由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在 280nm波長處。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。 ? 目前實(shí)驗(yàn)室多用 Folin酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 在堿性條件下極不穩(wěn)定 ， 易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng) （ 鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物 ） ， 蛋白質(zhì)中含有帶酚基的酪氨酸 ， 故有此反應(yīng) 。 相當(dāng)于雙縮脲試劑 。 3. Lowry法 (Folin酚法 ) ? Folin酚試劑由甲試劑與乙試劑組成 。 2. 雙縮脲法 ? 蛋白質(zhì)在堿性溶液中，能與 Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用來測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。 原理都是利用蛋白質(zhì)的成色反應(yīng)或紫外吸收的性質(zhì) ， 通過分光光度法來測(cè)定 。為獲得這些梯度設(shè)計(jì)出多種梯度混合器 K=(CR— CM) / V 第六節(jié) 蛋白質(zhì)的含量測(cè)定 與純度鑒定 一、蛋白質(zhì)含量測(cè)定 ? 目前總蛋白質(zhì)含量測(cè)定有兩類方法 ， ? 一類是利用蛋白質(zhì)的 物理性質(zhì) ， 如折射率 、比重 、 紫外吸收等測(cè)定得知 ， ? 另一類是利用 化學(xué)方法 測(cè)定蛋白質(zhì)含量 ， 如微量凱氏定氮 、 雙縮脲反應(yīng) 、 Folin酚試劑法 (又名 Lowry法 )。一般分離效果好，分辨率高，特別是使用交換容量小，對(duì)鹽濃度敏感的離子交換劑，多采用梯度洗脫。 R一 N+(CH3)30H一 十 C1— = R—N十 (CH3)3C1— +OH— ? 為了使蛋白質(zhì)從離子交換柱上洗脫下，需要降低它們之間的親和力，有效的方法是逐步 提高洗脫劑的 pH和 鹽濃度 (離子強(qiáng)度 )， 這樣各種蛋白質(zhì)將以不同的速度被洗脫下來。 當(dāng)引入仲胺和伯胺基團(tuán)時(shí) ， 為弱陰性離子交換劑 。 R—AH+Na+ = R—ANa+H+ 陰離子交換劑 陰離子交換劑是在樹脂中分別引入季胺 [一N+(CH3)3]、 叔胺 [一 N(CH3)2]、 仲胺 [一 NHCH3]和伯胺 [一 NH2]基團(tuán)構(gòu)成的 。 引入酸性基團(tuán)的交換劑可離解出 H+， 可以與溶液中的正電荷化合物或陽離子進(jìn)行交換反應(yīng) 。瓊脂糖、葡聚糖等 可解離基團(tuán) ： 酸性基團(tuán)： SO3H（ SE強(qiáng)酸型）、–COOH（ CM弱酸型）也稱 陽離子交換劑 堿性基團(tuán)： NH2 （ AE，弱堿型）， N（ CH3 ） 2 （ DEAE）， N+（ CH3） 3（強(qiáng)堿型）、也稱陰離子交換劑 陽離子交換劑 陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電 ， 反離子帶正電 。 離子交換層析 1 2 3 4 5 原始緩沖溶液的反離子 樣品溶液 梯度濃度 段 :離子交換劑與反離子結(jié)合 段：樣品與反離子進(jìn)行交換 4. 解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì) ：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用 B、離子交換劑 母體 ： 不溶性高分子。 親和層析的基本步驟： 離子交換層析是在以離子交換劑為固定相 ， 液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的 。 五、利用對(duì)配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法（親和層析） ? 親和層析 (affinity chromatography)是利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力，也即生物學(xué)親和力（ 底物和酶，抗原與抗體，酶與抑制劑，受體與底物等），建立起來的一種有效的純化方法。為了獲得好的分離效果，需要選擇合適的洗脫液。 ? 氧化鋁 :微堿性，適于分離酸性物質(zhì)。 ? 吸附層析 就是利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離目的的。 毛細(xì)管電泳的應(yīng)用 四、利用選擇性吸附的純化方法（吸附層析） ? 某些稱為吸附劑的固體物質(zhì)具有吸附能力，能夠?qū)⑵渌N類的分子吸附在自己的表面，吸附力的強(qiáng)弱因被吸物質(zhì)的性質(zhì)而異。 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ? 毛細(xì)管電泳高效分離、快速分析和微量進(jìn)樣的優(yōu)勢(shì)，使其在化學(xué)、生命科學(xué)、藥物學(xué)、法醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)學(xué)及食品科學(xué)等領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用， 適合于從無機(jī)離子到生物大分子，從荷電粒子到中性分子的分離分析 。 ? 對(duì) 荷正電 的分子來說，電泳遷移和電滲流效果是一致的，因而 移動(dòng)最快 ，最先達(dá)到負(fù)極。 ? 由于電滲速度一般比樣品的電泳速度大，使得攜帶不同電荷的分子朝一個(gè)方向運(yùn)動(dòng)。 毛細(xì)管電泳的原理 電滲： 在水性條件下大多數(shù)固體表面都帶有多余的負(fù)電荷。 ? 毛細(xì)管電泳是以彈性石英毛細(xì)管 （內(nèi)徑為 25100微米 散熱性好 ） 為分離通道，以高壓電場(chǎng)（可高至 30千伏） 為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間帶電性和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)的電泳分離的分析方法。 1966年瑞典 LKB公司生產(chǎn)出第一批載體兩性電解質(zhì) ， 商品名為 Ampholine， Serva公司的 Servalyte， Bio— Rad公司的 Biolyte， Pharmacia公司的 Pharmalyte， 國內(nèi)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所生產(chǎn)的載體兩性電解質(zhì)等 。 載體兩性電解質(zhì)的合成 1961年 Svensson 提出的載體兩性電解質(zhì)的理論基礎(chǔ) ， 1964年 Vesterberg 利用 多乙烯多胺 和 不飽和酸 合成了載體兩性電解質(zhì) ， 它是由 脂肪族多氨基多羧基的異構(gòu)物和同系物組成 ， 它們有連續(xù)改變的氨基與羧基比 。 可以用來測(cè)定蛋白質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)。 樣品可以加在膠板的任何部位。 隨著電泳時(shí)間的延長，區(qū)帶越來越窄。 保證了蛋白質(zhì)分離的高分辨率，是等電聚焦最為突出的優(yōu)點(diǎn)。如果它向等電點(diǎn)兩側(cè)擴(kuò)散，凈電荷就不再為0，都會(huì)被陰極或陽極吸引回來，直至回到凈電荷為 0的位置，因此蛋白質(zhì)在與其本身 pI相等的 pH位置被聚焦成窄而穩(wěn)定的區(qū)帶。 近年來，等電聚焦電泳技術(shù)的分辨率有了很大提高，可以分辨 pI只差 ，這是等電聚焦最突出的優(yōu)點(diǎn)， 蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的基本原理 在電泳支持介質(zhì)中加入 載體兩性電解質(zhì) (carrier ampholytes)，通以直流電后在正負(fù)極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的 pH梯度，蛋白質(zhì)在 pH梯度凝膠中受電場(chǎng)力作用下泳動(dòng)，它的分離僅僅決定于其本身的等電點(diǎn)。 SDS—凝膠電泳： 等電聚焦 (isoelectric focusing， IEF) 等電聚焦是 60年代建立的一種高分