蛋白質(zhì)分分離純化和表征(參考版)
2025-05-05 13:42本頁面
【正文】 。 ? 本法試劑配制簡(jiǎn)單 ， 操作簡(jiǎn)便 ， 是一種常見的蛋白質(zhì)快速微量測(cè)定方法 。 ? 考馬斯亮藍(lán) G250是一種染料 ， 在游離狀態(tài)下呈紅色 ， 與蛋白質(zhì)結(jié)合則呈現(xiàn)藍(lán)色 。 ? 福林 — 酚試劑法靈敏度高 ， 但是如果樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸差異較大時(shí) ， 會(huì)有較大的系統(tǒng)誤差 。 ? 在堿性溶液中蛋白質(zhì)可以與 Gu2＋ 形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成無關(guān) 。 ? 溶液中蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定方法很多，最早的經(jīng)典方法是凱氏定氮法，稍后應(yīng)用較廣泛的方法是雙縮脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年來大多數(shù)人用考馬斯亮藍(lán)法。然后再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來，從而達(dá)到分離提純的目的 。 物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個(gè)洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。 若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與 H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。 TrisGly pH= TrisGly pH= TrisHCl pH= T=3% TrisHCl pH= T=% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） kD 330 220 67 60 36 kD 94 67 43 30 Mol mass kD 300 200 100 80 60 50 40 30 20 10 Migration (Rf) Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis A stable pH gradient is established in the gel after application of an electric field. Protein solution is added and electric field is reapplied. After staining, proteins are shown to be distributed along pH gradient according to their pI values. 等電聚焦 (IEF) pH梯度制作：利用兩性電解質(zhì) (商品名 : Ampholine)，多氨基多羧酸系列兩性化合物同系物的復(fù)雜混合物，它們有相近但不同的pH和 pI值，在電場(chǎng)作用下，自然形成 pH梯度 . 電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負(fù)極 pH逐漸增加的 pH梯度 ， 處在其中的蛋白分子在電場(chǎng)的作用下運(yùn)動(dòng) ， 最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上 ， 測(cè)出蛋白分子聚焦位置的 pH值 ， 便可以得到它的等電點(diǎn) 。 電泳 :在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。 ? 利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使蛋白質(zhì)分離的方法 ， 有機(jī)溶劑沉淀法 。 ? 鹽析原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后 ， 水活性降低 ， 水化膜相繼被破壞 ， 最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚積并從溶液中析出 溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響 040℃ 之間 ， 大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度的升高而增加 。 ? 同一濃度鹽溶液中 ， 不同蛋白質(zhì)的溶解度不同 ， 借此可達(dá)到彼此分離的目的 。 因此 ， 等電點(diǎn)性質(zhì)常被用于蛋白質(zhì)的分離制備 ， 被稱為等
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