【正文】 ycerol,glycerol,同時(shí)還試了TGE,solution。賣(mài)的refolding來(lái)稀釋?zhuān)♂屃酥?，變性的GFP就開(kāi)始重折疊。然后把這些溶解的GFP溶液分到一個(gè)96孔板上,每個(gè)孔10微升，然后加入２０倍的refoldinghydrochloride（鹽酸胍）溶解變性，另一部分用sarkosylbody)。Burgess設(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)讓我們做。 　為了讓我們對(duì)這個(gè)穩(wěn)定到什么程度呢,就是你把這個(gè)酶加上50%glycerol，用平信從美國(guó)寄十幾天到澳洲，活性還有7~80%！另外Burgess也提到，如果要保存的蛋白有二硫鍵，加一點(diǎn)DTT，防止蛋白形成非天然的二硫鍵,polymerase混合了。Burgess有一次不小心出了錯(cuò)誤，把純化出來(lái)的RNA放冰上,那時(shí)候一個(gè)大問(wèn)題是RNA實(shí)驗(yàn)室里干，主要是純化細(xì)菌RNA這個(gè)穩(wěn)定的效果是十分驚人的。有了這個(gè)glycerol,NaClglycerol　　 Tris5%NaCl EDTA pH50mM EDTA。glycerol盡管他吹得神乎其神，配方卻十分簡(jiǎn)單。他告訴我們說(shuō)，他幾十年了，總喜歡用這個(gè)buffer的配方，什么蛋白都喜歡這種buffer,我們聽(tīng)得都目瞪口呆。black靈敏十倍以上。據(jù)他說(shuō)，六幾年的時(shí)候他看到一個(gè)澳洲的老兄的一片文章,講述一種新奇的染料叫考馬市亮藍(lán),比如，他得意說(shuō)他是全美國(guó)最早用coomassieBurgess（五）萬(wàn)金油buffer 　但我對(duì)她映象還是十分深刻，主要就是因?yàn)樗峭砼苤拥慕?jīng)歷。如果用這種方法，A就不用在實(shí)驗(yàn)室待一晚上了，因?yàn)橐磺卸际亲詣?dòng)完成的。　 當(dāng)然最簡(jiǎn)單的辦法還不是這個(gè)，最簡(jiǎn)單的辦法的是把盛有洗液的容器放高，然后利用虹吸的原理讓液體源源不斷的流經(jīng)柱子。有簡(jiǎn)單的辦法可以讓柱子跑得快一點(diǎn)的。所以她每隔二十分鐘就去加洗液，所以白白花了好幾個(gè)小時(shí)。column純化蛋白，由于beadsroom。這一等不得了，從晚上七點(diǎn)等到了凌晨一點(diǎn)。我原來(lái)很喜歡女生A,但我覺(jué)得對(duì)初做蛋白質(zhì)純化的人還是很有幫助的。如果你嫌液體流得太慢（尤其是洗柱子的時(shí)候），可以在柱子下端出口連一個(gè)長(zhǎng)的塑膠管子或者針管，這樣速 度會(huì)快很多。而hydrostatic液體流經(jīng)柱子速度由hydrostatic這種小柱子很簡(jiǎn)單，把beads倒進(jìn)去，沖洗一下就可以用來(lái)純化蛋白了，很方便。比如他特別提到了disposableBurgesspressure和跑小柱子的trick 　　 　從這里開(kāi)始，我要岔開(kāi)一下，講一些跟這個(gè)模塊實(shí)驗(yàn)沒(méi)太大關(guān)系，但是很有意思的東西。50陰離子交換柱，拿到的蛋白很少，回收率小于5%。剩下的上清跑了一個(gè)PorosBurgess臉色不好看，說(shuō)不應(yīng)該這樣的。HCl溶解的Sigma32。Burgess說(shuō)的還真象那么回事，可事實(shí)上，嘿嘿。就是放一大燒杯的緩沖液，里面有一個(gè)磁石可以不斷混合液體，然后一滴一滴加入變性的蛋白溶液。但是問(wèn)題也是類(lèi)似的。折疊中間產(chǎn)物容易相互接觸形成不溶的聚合物。這個(gè)方法Burgess并不喜歡，因?yàn)椋肝鍪莻€(gè)緩慢的過(guò)程。然后我們得去掉變性劑，做重折疊。bodyHCl（鹽酸胍)來(lái)變性，作為對(duì)比。 　Burgess還要我們?cè)嚵私?jīng)典的sarkosyl的優(yōu)點(diǎn)是，雖然在高濃度下有變性作用，低濃度下卻對(duì)蛋白質(zhì)有穩(wěn)定的作用。sarkosyl(N十二烷基肌氨酸鈉）是一種比較強(qiáng)的陰離子去垢劑,body。相當(dāng)穩(wěn)定，不溶于triton,所以這一步，絕大部分垃圾就被去掉了。來(lái)溶解細(xì)菌本身的一些蛋白，inclusion我們先用1%body),我們的任務(wù)就是要用變性 劑溶解變性不溶的蛋白，然后做重折疊。Sigmashock我們這個(gè)實(shí)驗(yàn) 的核心主角就是其中一個(gè)因子，叫sigma32。Sigma系列因子能夠識(shí)別啟動(dòng)子,RNA　polymerase。（三）這個(gè)課結(jié)束之后，他還跑到冷泉港書(shū)店買(mǎi)了一堆蟲(chóng)子毛絨玩具給兩個(gè)兒子做紀(jì)念品。另外，他有兩個(gè)未成年的兒子，喜歡不斷打他手機(jī)。后來(lái)發(fā)現(xiàn)此人相當(dāng)nice。Severinov副教授，這老兄是俄羅斯人，這四位老師中最年輕的一位。university 第四位教授是rutgers哈哈哈。有一天那個(gè)博后指著這老兄的鼻子說(shuō)，XXX呀，你把bench弄得太亂了，趕快給我清理干凈了。還有另一個(gè)笑話，suehwathat這老兄一看樂(lè)了，然后說(shuō)你既然沒(méi)種殺人或者自殺，就剩第三種選擇了,這個(gè)老兄說(shuō)看起來(lái)你丫沒(méi)這膽量，那還有第二種選擇，就是殺了你自己。第一種呢，就是既然你恨他，那就殺了他好了。有一天有一個(gè)學(xué)生向這個(gè)老兄投訴說(shuō)和實(shí)驗(yàn)室另一人有矛盾。她是一個(gè)身材瘦小的中年婦女，臺(tái)灣人，特搞笑，非常喜歡給我們講她博士后老板的笑話。center的suehwaanderson第三位教員是來(lái)自Texas mini,還在網(wǎng)上itunes商店買(mǎi)過(guò)歌。我知道后覺(jué)得特佩服，真正的科學(xué)家不應(yīng)該被自己過(guò)去所受的訓(xùn)練束縛死了，應(yīng)該是根據(jù)研究的需要隨時(shí)準(zhǔn)備學(xué)習(xí)新東西。后來(lái)做了faculty之后，決定用果蠅做模型來(lái)研究轉(zhuǎn)錄因子。Tjian我一開(kāi)始不太理解，后來(lái)問(wèn)他的學(xué)術(shù)經(jīng)歷，才明白是怎么回事。這老哥研究果蠅的,申請(qǐng)這個(gè)課前，我先跟他發(fā)過(guò)教授。的Albert但是Burgess又承認(rèn)watson對(duì)他自己的學(xué)生很支持，很提拔，這幾年又盡心盡力為冷泉港籌 款，貢獻(xiàn)巨大。watson此人口碑很不好，很自大。后來(lái)的有一天，我還真的看到了watson去找他聊天。這老頭很有意思，帶這個(gè)培訓(xùn)班已經(jīng)帶了十二年了，到現(xiàn)在還是樂(lè)此不?！，F(xiàn)在開(kāi)始八卦一下幾個(gè)老師，^_^ 總負(fù)責(zé)人是來(lái)自wisconsinmadison的Richard第三個(gè)是來(lái)自丹麥的Charlotte，是個(gè)博士生，做植物的。來(lái)自Princeton的Adam,做海洋生物學(xué)的。Boulder學(xué)生則一共有16個(gè)，分成四組，輪轉(zhuǎn)式的做完四個(gè)模塊。老師一共有四個(gè)，每人負(fù)責(zé)一個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)，持續(xù)三天時(shí)間, 老板人很nice,但是他實(shí)在沒(méi)錢(qián)了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解決了，去年的退稅就這樣全搭進(jìn)去了,waiver。我下定決心上這門(mén)課，于是遞交了申請(qǐng)。這是冷泉港享有盛名的最主要原因。每年都是四月初開(kāi)始，持續(xù)兩個(gè)星期。呵呵。torenown。意思是throughAd原始的諺語(yǔ)是,Per幾個(gè)大字。Ad課程結(jié)束之后，每一個(gè)學(xué)員都有一份證書(shū)，印著Per 想到哪說(shuō)到哪，文字挺松散的，見(jiàn)笑了。 這一系列文章是我對(duì)這次上課經(jīng)歷的全面總結(jié)，一部分是八卦，一部分是流水賬般的記敘，還有一些是從這課程學(xué)到的tricks, 而且當(dāng)時(shí)就動(dòng)了上這門(mén)課的念頭。這本書(shū)深深的吸引了我，因?yàn)槔锩嬗涗浀膶?shí)驗(yàn)十分經(jīng)典，涵蓋了蛋白質(zhì)純化中可能用到的大部分手段，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)有十分詳盡的解釋。這本書(shū)很奇怪，里面列出了很多具體實(shí)驗(yàn)的步驟和解釋。從純化到星辰CSH蛋白質(zhì)純化課側(cè)記Royluo 引子 　 2000年5月6日，我一個(gè)人在合肥三孝口書(shū)店閑誑,希望買(mǎi)點(diǎn)參考書(shū)帶出國(guó)去。我注意到有一本翻譯過(guò)來(lái)的書(shū)，書(shū)名叫做《蛋白質(zhì)純化與鑒定實(shí)驗(yàn)指南》。我很快意識(shí)到，這本書(shū)實(shí)際上是冷泉港實(shí)驗(yàn)室開(kāi)設(shè)的一門(mén)《蛋白質(zhì)純化與鑒定》實(shí)驗(yàn)課的教材。我對(duì)這本書(shū)愛(ài)不釋手，于是就買(mǎi)了下來(lái),這是一個(gè)很模糊的想法，沒(méi)有想到的是，五年以后這個(gè)想法竟然實(shí)現(xiàn)了。最后也摻雜著自己過(guò)去做蛋白質(zhì)純化的心得。 我來(lái)解釋一下標(biāo)題。PuraAstra這是拉丁語(yǔ)，直譯就是“從純化到星辰”。AsperaAstra,suffering所以“從純化到星辰”實(shí)際的意思是，做好蛋白質(zhì)純化，以后就容易出人頭地。（二）同學(xué)和老師 　冷泉港的《蛋白質(zhì)純化與鑒定》培訓(xùn)班歷史相當(dāng)悠久，從1989年開(kāi)始每年都開(kāi)課，到今年是第十六次。值得一提的是，冷泉港有相當(dāng)多的培訓(xùn)班和會(huì)議，是一個(gè)科學(xué)家交流和學(xué)習(xí)的中心。 　2004年底,二月份的時(shí)候的到消息，我被錄取了，并且還有1000刀的tuition可我還是高興不起來(lái)，因?yàn)檫€得解決1600刀(學(xué)費(fèi)一共2600刀)。欲哭無(wú)淚啊?！∷脑挛逄?hào)下午我趕到冷泉港，辦完登記手續(xù)后被告知晚上七點(diǎn)全體開(kāi)會(huì)，與教員和同學(xué)見(jiàn)面。每個(gè)老師都有一兩個(gè)助手幫忙。我這一組其他三個(gè)人是:來(lái)自colorado的chad,做有絲分裂的。Chad和Adam都是博士后。 Burgess教授,他六十年代是watson的博士后，watson似乎跟他關(guān)系很好，每年純化課的時(shí)候，watson都會(huì)跑到培訓(xùn)班的實(shí)驗(yàn)室找Burgess聊天，同時(shí)拉他去吃飯什么的。不過(guò)令人驚訝的是，watson此人相當(dāng)精神，走路象年輕人。連Burgess教授一次和我們吃飯的時(shí)候都承認(rèn)，watson有時(shí)候口無(wú)遮攔，讓他都覺(jué)得很難堪。 　第二位教員是來(lái)自UCLACourey這位教授人很nice也很幽默，四位老師中我對(duì)他印象 最好。詢問(wèn)這個(gè)課的情況，而他也鼓勵(lì)我申請(qǐng)。但是他卻負(fù)責(zé)教一組純化轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)驗(yàn)。原來(lái)這老哥博士是做生化，博后跟的是robert（錢(qián)澤南），還是做生化，研究轉(zhuǎn)錄因子。他那時(shí)侯不懂果蠅的遺傳學(xué)，完全靠自學(xué)和到處問(wèn)人。這老哥雖然不是最年輕的，但是卻很能跟上年輕人的潮流，比如他說(shuō)他有一個(gè)ipod我還跟他就ipod聊了一陣子，因?yàn)槲乙灿袀€(gè)ipod。MDcancerlin教授。一個(gè)笑話是這樣的,這個(gè)老兄想了想，然后一本正經(jīng)的說(shuō)，和人產(chǎn)生矛盾了，一般有三種選擇。那個(gè)學(xué)生聽(tīng)了之后，差點(diǎn)倒了。那個(gè)學(xué)生聽(tīng)了幾乎要吐血。就是ignoreguy!!!哈。lin的 博士后老板雖然當(dāng)了老板，但是還是喜歡做實(shí)驗(yàn)，并且和一個(gè)博后共用一個(gè)bench。這老兄聽(tīng)了之后也不怒，而是慢條斯理的辯解說(shuō)，每個(gè)人都有自己喜歡的工作方式，我喜歡亂，你丫管我呢，要是不喜歡，我們可以在bench上畫(huà)條線劃清界線，從此井水不犯河水。這老美連三八線都出來(lái)了。的konstantin此君滿頭亂發(fā)，一臉大胡子，看起來(lái)很邋遢，所以一開(kāi)始我對(duì)他印象不佳。Konstantin特搞，有一次他做報(bào)告，他的電腦的桌面上有一堆亂七八糟的文件夾，其中有一個(gè)竟然是divorce!我告訴坐我旁邊的一個(gè)老美，老美說(shuō)也注意到了，認(rèn)為實(shí)在是很sad，呵呵。結(jié)果他常常講實(shí)驗(yàn)講到一半就得停下來(lái)接電話。舔犢情深，可見(jiàn)一斑。不溶的sigma32 　　四月六號(hào)早上，我們開(kāi)始了第一模塊的實(shí)驗(yàn)，Burgess教授負(fù)責(zé)。polymerase 核心酶是一個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體，只有合成RNA的活性，卻沒(méi)有識(shí)別DNA的能力。并且與核心酶結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄。Sigma32可以識(shí)別heatgenes的啟動(dòng)子。32過(guò)表達(dá)在大腸桿菌里面的時(shí)候，絕大部分形成了不溶的包涵體(inclusion 所有的buffer幾乎都已經(jīng)配好了，所以直接做就行了。Tritonbody 下一步就是用變性劑來(lái)溶解inclusion用什么好呢？Burgess教授提到了sarkosyl。%的濃度就可以讓包涵體溶解。所以用sarkosyl做重折疊之前的變性劑是再好也不過(guò)的了。Gudninclusion在這兩種變性劑下很容易就溶解了。怎么做呢？方法有很多種，最簡(jiǎn)單的是透析，把變性劑全部換掉。在透析袋里面，蛋白的濃度還是很高。另一種方法是突然稀釋變性的蛋白，由于蛋白濃度相對(duì)與透析低了很多，好一點(diǎn)。Burgess提議用逐步滴加稀釋的辦法。由于燒杯里的溶液蛋白量是逐漸增加的，所以一開(kāi)始蛋白折疊中間產(chǎn)物能夠相互作用的幾率大大降低了。我們先用試著重折疊Gudn一開(kāi)始還好，滴到后來(lái)，溶液就變渾濁了，最后幾乎成了沖淡了的牛奶那樣的東東。我們一離心，沉淀出來(lái)一大堆不溶解的蛋白。HQ失敗啊。（四）HydrostaticDr.假定我們對(duì)蛋白質(zhì)純化一無(wú)所知，所以講得很細(xì)致。column的用法。唯一的問(wèn)題是，由于是依靠重力跑，速度有時(shí)候會(huì)十分慢。pressure(靜流體壓力）來(lái)決定。pressure又是由實(shí)際柱高(即液體經(jīng)過(guò)的長(zhǎng)度)來(lái)決定。這是很簡(jiǎn)單的小trick, 　　我知道一個(gè)例子。有一天晚上主動(dòng)等在她實(shí)驗(yàn)室等她做完實(shí)驗(yàn)，就開(kāi)車(chē)送她回家。這個(gè)過(guò)程中，她好像沒(méi)什么事情，但是每隔20分鐘，她就會(huì)去一次cold作完實(shí)驗(yàn)了之后，我好奇的問(wèn)她，到底是什么試驗(yàn)花了這么長(zhǎng)時(shí)間，結(jié)果她說(shuō)她在用一個(gè)disposable稍微多了一點(diǎn)，速度很慢，而protocol有一步要求用數(shù)百毫升的洗液來(lái)沖洗柱子。我聽(tīng)了之后都要ft了,沒(méi)想到她們實(shí)驗(yàn)室竟然沒(méi)有人告訴她,只要在下端出口加一個(gè)長(zhǎng)管子，她至少可以少等兩個(gè)小時(shí)。同時(shí)，柱子的下端連上塑膠管，彎成一個(gè)連通器，這個(gè)連通器的高度應(yīng)該略高于柱面，這樣沖洗結(jié)束后，柱子就不會(huì)干。 　我現(xiàn)在跟A已經(jīng)完全沒(méi)有來(lái)往了,話撤遠(yuǎn)了，現(xiàn)在再回到蛋百質(zhì)純化課。Dr.這人特有意思，喜歡吹噓他發(fā)現(xiàn)的小trick。blue染蛋白膠的人。比當(dāng)時(shí)流行的染料amido所以他就寫(xiě)了一封信要了一些，結(jié)果效果奇好。 　不過(guò)Burgess最自豪的，還是他的“萬(wàn)金油”buffer?？梢哉f(shuō)到了包治百病的神奇地步。這個(gè)buffer叫TGE,就是Tris,和配方是這樣的: Tris 50mMEDTA這三樣都沒(méi)什么，真正關(guān)鍵的是5%glycerol。很多蛋白，尤其是酶會(huì)十分穩(wěn)定。六十年代的時(shí)候，他還是個(gè)小博士后，在watsonpolymerase的各個(gè)亞基。polymerase純化出來(lái)后十分不穩(wěn)定,過(guò)30分鐘，活性還會(huì)損失一半。polymerase和glycerol結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)，RNA變得十分十分的穩(wěn)定。也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有好處。萬(wàn)金油buffer的好處有感性認(rèn)識(shí),他之前已經(jīng)準(zhǔn)備好了在大腸桿菌中表達(dá)的GFP包涵體(inclusion我們把包涵體分成兩部分，一部分用guanidinium(N十二烷基肌氨酸鈉）溶解變性。buffer我們有一個(gè)hampton試劑盒，內(nèi)有十幾種不同配方的refolding我們?cè)嚵怂羞@些bufferTGE+1