【正文】 呢，就得考慮怎么把ligand偶連在beads上了。CNBr活化是最常用的一個(gè)方法。imido蛋白質(zhì)或者核酸的伯胺基團(tuán)(primary, 蛋白質(zhì)的primary如果要偶連的蛋白沒有l(wèi)ysine用這種偶連方法就不好。amine來自于AGC三種堿基。amine都要形成氫鍵。oligo固定好，必須 得有不配對(duì)的overhang才行。resin,affinityfiltration，用的是Amersham賣的Superose純化步驟就只有這么多了。無論是sephacryl分出來的組分還是DNAcolumn分出來的組分，我們都測(cè)試了AP1的活性。足跡分析Iassay)，都可以用來分析蛋白與特定DNA的結(jié)合能力。 　　　Gelassay然后拿去跑一個(gè)低濃度acrylamide膠。然后把膠拿去做放射自顯影就行了。把兩大塊玻璃板和兩片spacer夾起來之后,plug，就是配少量gel溶液，然后加過量的TEMED，然后迅速加到玻璃板中間，這些膠還沒漏完就會(huì)凝固，所以會(huì)封住底端。講，這個(gè)方法雖然很粗糙，但是比其他任何封底的辦法都管用。是這樣的，由于膠的濃度低，比較脆弱，另外尺寸比較大。我們做膠的時(shí)候，指導(dǎo)老師要我們把一塊玻璃板的貼著膠的一面硅化（用sigmacote,一下，使得這一面比較疏水，就不會(huì)與膠粘在一起了。生物實(shí)驗(yàn)要想令人心服口服，沒有對(duì)照是不行的。陽性對(duì)照很簡單，是看看系統(tǒng)能不能work。EMSA的陰性對(duì)照有兩種，一種呢，是用來看和探針的結(jié)合的蛋白是不是特異的某一種蛋白。plex,在膠看起來就是探針的遷移率進(jìn)一步降低了。另一種對(duì)照呢，是看蛋白質(zhì)與探針的結(jié)合是不是與探針序列有關(guān)，因?yàn)槿绻欠翘禺愋缘慕Y(jié)合，純化就沒有意義了。如果加入完全同序列的競(jìng)爭(zhēng)DNA可以削弱proteinDNA 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中用了 第二種control, MobilityshiftDNAasefootprinting正是用來解決這個(gè)問題的。Iladder一樣的東西。I無法酶切那一部分，我們看到的ladder這樣我們可以知道那一部分沒有被切到。I首先是做同位素標(biāo)記探針的stockstock有一種成分引起了我的注意，聚乙烯醇(polyvinyl 這東東比較粘稠，為什么要加它呢？大家想想看，用來做DNAasefootprinting的樣品都是通過跑柱子的fractions，轉(zhuǎn)錄因子必定是被稀釋得很厲害的。聚乙烯醇性質(zhì)就象一個(gè)分子海綿，占溶液體積不說，還跟蛋白質(zhì)搶奪水分子，所以加入這個(gè)東東之后呢，蛋白質(zhì)和探針的有效濃度都增大了，這樣有利于蛋白質(zhì)和探針的相互結(jié)合。探針stock之后呢就是做DNAse酶切。為什么呢？酶切一共有三步，間隔時(shí)間很短。第二步是加DNase孵育一分鐘,我們是三個(gè)三個(gè)一做,這樣三分鐘三個(gè)樣品都完成了?？赡苁翘o張了把，我們連犯了兩次錯(cuò)誤，漏加了Ca/Mg，只得重做幾個(gè)樣品。 好了，第二模塊的實(shí)驗(yàn)，到這里就差不多了。全體成員放假一天休息，而放假前一天晚上也沒有報(bào)告。（十六）浮起來的細(xì)胞膜 第二天 早上，第三個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)開始了。Lin， 這一個(gè)模塊是從大鼠肝臟里面提取胰島素受體并且做一些鑒定。主要是因?yàn)檫@是唯一一個(gè)設(shè)計(jì)膜蛋白純化的實(shí)驗(yàn)，而膜蛋白純化是所有蛋白質(zhì)純化中最麻煩的一類。胰島素受體即使溶解在去垢劑里面也能與胰島素接合，所以用簡單的binding相比之下有些受體就不那么好伺侯了，比如我研究的Notch受體，配體也是膜蛋白，Notch和配體必須都簇集在細(xì)胞表面或者固體表面才能有接合，溶液中的游離狀態(tài)下根本沒法相互作用。Lin是一個(gè)好老師，喜歡在做實(shí)驗(yàn)之前詳細(xì)給我們講解背景知識(shí)，這一 點(diǎn)上她比其他三位老師都做得好。assistant這位助手特別nice，給我?guī)椭艽蟆Ｊ紫仁前汛笫蟾闻K的質(zhì)膜部分分離出來，然 后呢用去垢劑溶解一下，用凝集素層析來粗分一下組分，然后做受體測(cè)活與鑒定。事實(shí)上，手冊(cè)上這個(gè)實(shí)驗(yàn)里面還得做一步insulinchromatography來精制一下的。我覺得這種做法很不明智，因?yàn)橹亟M蛋白純化的實(shí)驗(yàn)實(shí)在不需要花幾千刀來冷泉港學(xué)的。in細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)主要有核膜，質(zhì)膜，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，溶酶體等等。其它的膜結(jié)構(gòu)中呢，線粒體是最重的，質(zhì)膜由于有膽固醇成分，所以是最輕的。剩下的膜結(jié)構(gòu)比重比較相似，所以不好分。差速離心（differential其實(shí)很簡單，就是用不同的速度離心三次。第一次是低速離心，只用600g，這么小的離心力下，只有未破的細(xì)胞和細(xì)胞核才會(huì)沉淀下來。拿上清再做第二次離心，這回離心力大了一個(gè)數(shù)量級(jí)，到了8000g。去上清進(jìn)行第三次離心，這回離心力比前一次又要大一個(gè)數(shù)量級(jí)到了十萬g。需要強(qiáng)調(diào)的是，差速離心的分離是非常粗糙的，并不是十分干凈。但不管是什么分離方法，本質(zhì)上都不完美，千萬不要指望從某篇文章找到一個(gè)方法就能套用。membrane, 　　我們分離質(zhì)膜用的方法稍微特殊一點(diǎn)，省掉了差速離心這一步。我們一組四個(gè)人，每人都分了一個(gè)新鮮冰凍的大鼠肝臟（解凍后很難聞），然后就是拿刀片剁啊剁。勻漿用的緩沖液里面加有Ca2+，比較重要。我們把勻漿用兩層cheese然后就是用1500g離心了。然后再把pellet轉(zhuǎn)移到Dounce勻漿器再弄均勻了。gradient)。我們首先往pellet蔗糖的濃度十分的重要，如果不準(zhǔn)的話，根本就沒法分開。這個(gè)折射儀看起來很粗糙，但是卻十分好用。前面提到過，質(zhì)膜相比其他膜結(jié)構(gòu)而言是比較輕的，所以呢，在離心的過程中就會(huì)浮到上層來。這層質(zhì)膜看起來有點(diǎn)像果凍，可以用小勺舀出來?！。ㄊ撸┖稳ズ螐纳弦徽绿岬綇拇笫蟾闻K提取質(zhì)膜的方法。最主要的問題是：用什么去垢劑呢？，純化完之后再比較不同去垢劑的蛋白質(zhì)純化效率，看看哪一種去垢劑最有效。事實(shí)上，純化膜蛋白時(shí)去垢劑的選擇是沒有規(guī)律可循，除了一些顯而易見的不適和做純化的去垢劑(比如SDS)外，很難講什么去垢劑好什么去垢劑不好。我們這一組人選的四種去垢劑分別是:X100,Cholate,和Octyl我選的是Octyl好了，我先來講講去垢劑的小常識(shí)。這里就權(quán)當(dāng)拋磚引玉了。雖然脂類化合物也有類似性質(zhì)，但是去垢劑能夠形成膠束(micelle)，所以相比之下非常易于在水中溶解。X100或者NP40)。cholate)比如CHAPSglucoside,比如Triton Triton 它們實(shí)際上是同一種去垢劑，疏水基團(tuán)是取代苯基，而親水基團(tuán)是聚乙氧乙醇基團(tuán)。如果用在蛋白質(zhì)純化里面，很有可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)的活性。X100都是小包裝，而且在包裝瓶子里面充有惰性氣體。我強(qiáng)烈建議大家以后選擇和使用去垢劑的時(shí)候先考慮以下幾個(gè)問題：(1)選擇的去垢劑是否干擾蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定？X100之類的去垢劑有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，所以在280nm有很強(qiáng)的吸收。另外，有些去垢劑會(huì)嚴(yán)重的干擾一些protein比如常用的Bradfordblue這種染料在酸性條件下呈現(xiàn)為褐色膠體物質(zhì)，但在與疏水物質(zhì)結(jié)合之后會(huì)變得穩(wěn)定而呈現(xiàn)藍(lán)色。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)一開始專門做了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)Tritoncholate對(duì)Bradford干擾比較嚴(yán)重，chaps,glucoside基本上沒有什么干擾。assay方法。因?yàn)楹芏嗳ス竸?huì)形成膠束結(jié)構(gòu)，分子量非常大，所以沒法用簡單的透析或者超濾來去掉。X100和NP40,所以膠束的分子量有87KD了,這顯然是沒有辦法用透析來去掉的。膠束分子量只有6KD,用透析就很容易去掉了。所以如果要用到離子交換柱，要用非離子型或者兩性離子型的去垢劑?！　　?4)如果在后續(xù)步驟中選用凝集素層析,因?yàn)楹芏嗄さ鞍锥加刑腔揎?，凝集素層析可以利用這種性質(zhì)來純化一些膜蛋白。Glucoside的去垢劑，親水基團(tuán)是糖或者糖的衍生物，有可能與凝集素結(jié)合，降低凝集素的純化效果。agarose常常被用來純化具有Highmannose如果此時(shí)用Octyl glucoside，就無法純化蛋白了，因?yàn)镺ctyl(5)是否需要用弱的去垢劑來去掉soluble比如Sodiumreceptor之類的膜蛋白,membrane去掉大量的可溶蛋白雜質(zhì)。phaseX114是一種很特別的去垢劑，在室溫下很容易溶解在水中，但是在３０攝氏度以上會(huì)從水相中脫離出來，并且連帶的把膜蛋白也一起拽出來。這種方法叫做，twopartitioning。receptor。我們?cè)谠囼?yàn)中，先測(cè)了一下起始樣品的蛋白總濃度，然后以detergentprotein(8)選用的去垢劑是否影響所純化蛋白的活性？有些情況下，某些十分嬌貴的蛋白質(zhì)對(duì)一些去垢劑很敏感。但是，我覺得大家至少得意識(shí)到，去垢劑很有可能干擾蛋白活性的。我是做糖基轉(zhuǎn)移酶的。Omannosyltransferase是一種膜蛋白，跟muscular很多實(shí)驗(yàn)室都懷疑這種蛋白是糖基轉(zhuǎn)移酶，但是很長一段時(shí)間里面，很多實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)表達(dá)的重組蛋白都沒有活性。之所以很多實(shí)驗(yàn)室之前都不成功，其中一個(gè)重要因素就是去垢劑。X100和NP40是很常用的去垢劑。X100，表達(dá)的Proteinthioglucoside就有活性了！所以呢，如果大家試圖表達(dá)一個(gè)膜蛋白，卻沒有活性，不妨換一下去垢劑，說不定會(huì)有意外的驚喜。我們用去垢劑溶解了膜蛋白之后，緊跟著的一步就是用WheatAglutinin(WGA)receptor?，F(xiàn)在常用來做蛋白質(zhì)純化的凝集素絕大部分是從植物中提取出來的。domain和分泌蛋白都有Nlinked的糖基修飾。agarose或者ConA注意，只能是部分提純，凝集素層析并不能一步登天，讓蛋白質(zhì)比活力一下子提高上千倍，至多幾十倍就已經(jīng)很不錯(cuò)了。純化膜蛋白用的最主要的兩種凝集素是WGA和ConA。glycans。glycans 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常見的一種糖基修飾。domain如果膜蛋白有這個(gè)sequence,Nglycan是一個(gè)Oligosaccharide 結(jié)構(gòu)，好像一個(gè)分叉的樹枝一樣。lumen，同時(shí)就會(huì)被加上一整個(gè)樹枝狀的Nglycan這個(gè)Nglycan加上去之后，并不是就大功告成了，而是要經(jīng)歷一系列“裁減”，有的糖基會(huì)被去掉，新的糖基又會(huì)被加上，這樣最后的Nglycan 但是Nglycan的“主干”都是相似的.　　　Man\Man/GlcNAcGlcNAcNXS/TMan代表Mannose甘露糖，而GlcNAc代表N乙酰葡萄糖胺.保留在ER或者CisGolgi的膜蛋白,Nglycan往往是Highmannose在這種Nglycan的末端有很多甘露糖(mannose)修飾。ConA主要識(shí)別alphamannose,分泌出去的蛋白，或者已經(jīng)到細(xì)胞表面的膜蛋白的Nglycan往往是plex這種plexNglycan的末端往往修飾有Sialic而WGA主要識(shí)別GlcNAc和Sialicacid溶液?！。ㄊ牛㎝DABF1的啟示凝集素層析實(shí)際操作起來很簡單，跟過簡單的Ni柱子一樣。胰島素受體不是酶，所以測(cè)活是利用胰島素與受體的特異結(jié)合。然后加PEG（PolyGlycol6000沉淀胰島素受體，而游離的胰島素不會(huì)被沉淀下來。是這樣的，她實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一個(gè)蛋白質(zhì)因子這個(gè)因子對(duì)Osteoblast（成骨細(xì)胞）的增長有促進(jìn)作用。首先一步呢，就是得有一個(gè)測(cè)活方法。receptor的測(cè)活方法而設(shè)計(jì)了一個(gè)方法,結(jié)果呢，這個(gè)測(cè)活試驗(yàn)完全失敗了。PEG作為一種多元醇，可以想像為一種“分子海綿”，可以吸附水分子。這就是為什么insuline而游離的胰島素本身分子量很小，只有不到10KD，而且非常易溶，所以即使加了PEG，也沉淀不下來。Lin發(fā)現(xiàn)的MDABF1因子，分子量相對(duì)insulin大了好多，有50多KD，所以游離的因子也能被PEG沉淀下來。所以呢，我感覺做實(shí)驗(yàn)，僅僅是follow一定得搞清楚原理是怎么回事，這樣出了問題才知道怎么去改進(jìn)。MDABF1不僅僅給我以上的啟示。 其中她重點(diǎn)談到了MDABF1這個(gè)因子。她的測(cè)活方法是這樣的，首先表達(dá)MDABF1的重組蛋白，然后用同位素標(biāo)記，然后做binding這個(gè)binding很麻煩，因?yàn)闆]辦法用簡單的手段把游離的MDABF1和與受體結(jié)合上的MDABF1分開，只能用gelcolumn來分開，每做一次assay都很麻煩。為什么呢?純化蛋白的過程中，各種膜蛋白都處于一種被去垢劑溶解的勻漿狀態(tài)，這種情況下，一些正常生理?xiàng)l件下不會(huì)與MDABF1結(jié)合的受體可能也會(huì)與其結(jié)合。另外一種可能性是:這種binding需要強(qiáng)調(diào)的是，蛋白質(zhì)純化絕對(duì)不是萬能的。這一個(gè)模塊的純化試驗(yàn)到此就為止了。,OctylCholate則差好多。原始的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)上還有進(jìn)一步的insulinchromatography和其他分析。比如一個(gè)實(shí)驗(yàn)是從SF9里面純化一個(gè)his%$amp。我這一組其他幾個(gè)人還把這個(gè)試驗(yàn)當(dāng)寶，搶著做。gel。純化胰島素受體的模塊結(jié)束之后，我們這一組人進(jìn)入到最后一個(gè)模塊，做鈣調(diào)蛋白的純化和分析。這個(gè)蛋白只有148個(gè)氨基酸，大概16KD，比較小。nucleotide一些proteinphosphatases這一個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)中，我們是從雞胗里面提取和純化鈣調(diào)蛋白，然后再做一些分析。不過我對(duì)這個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷并不是很滿意。教員叫Constantin，是一個(gè)俄羅斯人，在rutgers當(dāng)教授?！　≌麄€(gè)純化步驟大概是這樣的。然后再做等電點(diǎn)沉淀，把Calmodulin沉淀下來。然后再過陰離子交換柱DEAEA50。blue都可以染出來。但我多少有一點(diǎn)本末倒置的感覺。然后才能逐漸制定最優(yōu)化的純化策略。一般有下列幾種方法。(2)生物活性不會(huì)因?yàn)橥肝龆鴣G掉(3)Urea之類的變性劑是否降低生物活性(4)對(duì)化學(xué)修飾劑(比如sulfurblocker我們提取鈣調(diào)蛋白所用的組織原料，雞胗，量挺大的，有一斤之多，紅紅的一大堆肉