蛋白質(zhì)的分離純化和表征-閱讀頁
2025-05-15 06:38本頁面
【正文】 ： %； （ 5）電源極性易轉(zhuǎn)換； 2. 毛細(xì)管柱 （ 1）材料：石英：各項(xiàng)性能好；玻璃：光學(xué)、機(jī)械性能差； （ 2）規(guī)格：內(nèi)徑 20～75μ m，外徑 350～ 400μ m；長度 =1m 毛細(xì)管結(jié)構(gòu) 毛細(xì)管是 CE分離的心臟。毛細(xì)管內(nèi)徑一般為 10 ～ 100μm，其截面結(jié)構(gòu)圖標(biāo)意圖如左圖所示。 兩性化合物在此電泳過程中 ， 就被濃集在與其 pI相等的 pH區(qū)域 ， 從而使不同化合物能按其各自等電點(diǎn)得到分離 。蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在 pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn) pH時(shí)被洗出。 pH梯度溶液的形成示意圖 蛋白質(zhì) 1（ pI=7） 蛋白質(zhì) 2（ pI=8） 流速 移動(dòng)速率 層析時(shí)的聚焦效應(yīng)示意圖 6. 離子交換層析 （ ionchange chromatography） 原理 基質(zhì) 疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑 應(yīng)用 制備純化生物物質(zhì) 定量 、 定性測(cè)定混合物中各組分 :離子交換劑與反離子結(jié)合 ：樣品與反離子進(jìn)行交換 4. 解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì) ：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用 1 2 3 4 5 原始緩沖溶液的反離子 樣品溶液 梯度濃度 離子交換層析原理示意圖 蛋白質(zhì)濃度 洗脫體積 帶正電荷的蛋白質(zhì) 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) 收集樣品的管 收集樣品的管 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)混合物 玻璃柱 帶正電荷的蛋白質(zhì) 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) 帶正電荷的蛋白質(zhì) 收集樣品的管 NaCl NaCl梯度 梯度混合器 凝膠顆粒 蛋白質(zhì)混合物 大分子 小分子 儲(chǔ)液瓶 混合瓶 層析柱 磁力攪拌器 洗脫劑體積（ mL） 洗脫劑濃度 簡單型梯度混合器 梯度洗脫曲線 洗脫劑體積（ mL） 洗脫劑濃度 儲(chǔ)液瓶 混合瓶 復(fù)合型梯度混合器 梯度洗脫曲線 凸形 線形 凹形 常用的陽離子交換劑 離子交換劑 可電離基團(tuán) 可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu) CM纖維素（弱酸型） 羧甲基 P纖維素（中強(qiáng)弱酸型） 磷酸基 SE纖維素（強(qiáng)弱酸型） 磺乙基 SP纖維素（強(qiáng)弱酸型） 磺丙基 常用的陰離子交換劑 AE纖維素（弱減型） 氨基乙基 離子交換劑 可電離基團(tuán) 可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu) PAB纖維素（弱減型） 對(duì)氨基苯甲酸 DEAE纖維素 二乙基氨基乙基 DEAE Sephadex 二乙基氨基乙基 DEAE 纖維素（強(qiáng)減型） 二乙基氨基乙基 QAE纖維素（強(qiáng)減型） 二乙基（ 2羥丙 基） 氨基乙基 （中弱減型） （中弱減型） （四）利用選擇性吸附的純化方法 ? ◇ ? ◇ 某些稱為吸附劑的固體物質(zhì)具有吸附能力，能夠?qū)⑵渌N類的分子吸附在自己的表面，吸附力的強(qiáng)弱因被吸物質(zhì)的性質(zhì)而異。吸附層析就是利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離目的的。 ? 吸附劑羥磷灰石即結(jié)晶磷酸鈣，它用于分離蛋白質(zhì)或核酸。 ? 據(jù)推測(cè)，蛋白質(zhì)中帶負(fù)電基團(tuán)與羥磷灰石晶體表面的鈣離子結(jié)合，而帶正電基團(tuán)與磷酸基相互作用。羥磷灰石對(duì)雙鏈DNA親和力很大，以致用羥磷灰石層析能從含 RNA和蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取液中選擇性地除去 DNA羥磷灰石對(duì)蛋白質(zhì)的吸附容量比較大，在一般吸附條件下（底離子強(qiáng)度，中性 pH）可達(dá)50g蛋白 /L柱床體積。 在疏水作用層析中，不是暴露的疏水基團(tuán)促進(jìn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，而是連接在支持介質(zhì)（如瓊脂糖）上的疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)表面上暴露的疏水基團(tuán)結(jié)合。 ? 為使吸附達(dá)到最大，可將蛋白質(zhì)樣品的 pH調(diào)至等電點(diǎn)附近。 （五）利用配體的特異性親和力的純化方法 ? 親和層析是利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力，也即生物學(xué)親和力，建立起來的一種有效的純化方法。親和層析最先用于酶的純化并從中得到發(fā)展，但現(xiàn)在已廣泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受體、細(xì)胞器甚至完整的細(xì)胞的純化。 目前采用的電泳分析有等電聚集、聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）和 SDS PAGE、毛細(xì)管電泳等。由于沉降系數(shù)主要是由分子大小和形狀決定的，而與化學(xué)組成無關(guān)，因此作為鑒定純度的方法，它要比電泳分析差些。
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