【正文】 y6預(yù)裝柱子?！　　〉诙€(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)，DNA 了解一些基本的偶連方法的化學(xué)原理是很有用的。所以呢，要想把DNADNA的primaryNH2) 與其發(fā)生反應(yīng)， 形成共價(jià)鍵聯(lián)在beads上。carbonate的中間產(chǎn)物, 由于這個(gè)酶與兩個(gè)底物都有結(jié)合， 所以可以把這兩種底物分別結(jié)合在beads上，然后跑兩次親合層析。beads 之類的東西， 幾乎所有人都會(huì)用到。Affinity通用的親合層析包括IMAC(Immobilized勉強(qiáng)答應(yīng)把自己名字署在在那個(gè)學(xué)生的文章，還強(qiáng)調(diào)如果沒有別人能重復(fù)，自己心就是懸著的。這些技術(shù)，也沒Nibeads這些東西，Nibeads也是親合層析的一種，是好多年以后才發(fā)明的。hydrophobicinteraction。Anfinsen是一個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)獲得者，可以說是蛋白質(zhì)折疊研究的老祖宗。 　親合層析是目前最常用也最強(qiáng)大的一種蛋白質(zhì)純化技術(shù),DNA整套裝置不貴，功能卻很齊全。所以我們?cè)谧龅臅r(shí)候，是從下端上樣的。第二個(gè)就是確定樣品會(huì)被稀釋多少。第一個(gè)就是確定void測試過程很簡單，就是跑一下藍(lán)色葡聚糖(blue接觸不緊密的話，等于是沖淡了樣品，分辨率會(huì)降低。然后就是接上蠕動(dòng)泵(peristaltic沉降３０分鐘后，就可以打開柱子的下出液口，讓多余的緩沖液流出去。不均勻不說，還有一大堆氣泡。一開始就是洗resin了，用粗制燒結(jié)玻板過濾的漏斗來洗，感覺這方法還挺快的。按道理說，要提高分辨率，柱子應(yīng)該是越長越細(xì)才好，這種柱子雖然不短，但是挺粗的。XK26/40的空柱子，然后往里面填充Sephacryl（十三）裝柱子的學(xué)問。不能很精細(xì)的純化蛋白，但是它還有另兩個(gè)非常重要的用途。 　　嘮叨了一大堆，我想表達(dá)的一個(gè)中心意思就是：如果你想從一個(gè)蛋白質(zhì)混合物很干 凈的把一個(gè)蛋白純化出來，Gel另外柱子里的微珠大小均勻一些也會(huì)有幫助。:)　 現(xiàn)在想起來，這實(shí)在是個(gè)昏招。她想要的蛋白50kD,而那個(gè)降解的產(chǎn)物有30KD。另外，兩個(gè)不同大小蛋白的洗脫體積的差別與分子量差別的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，所以可以想見，如果分子量相近（比如只差兩三倍）的話，洗脫位置也會(huì)相近，Gelfiltration但是這個(gè)特點(diǎn)也給Gel和其他色譜方法一個(gè)顯著的不同是：Gel 如果 蛋白質(zhì)分子體積不是那么大，可以通過微珠的孔狀結(jié)構(gòu)，就會(huì)遲一些被洗脫下來。GelGelcolumn。（十二）Gel沉淀重懸一下就可以跑Sephacryl按理說，到這一步就可以上柱子了，但是這種上清溶液里面還有不少histoneKCl)來破碎細(xì)胞核。耗子根本不能分解吸收這種化合物，就積累在肝臟細(xì)胞的lysosome里面，使得lysosome比重變輕了一些，這樣就可以把lysosome從mitonchondria和peroxysome分出來了。有些時(shí)候，可以用一些古怪的辦法來分離。而其他細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞膜的成分比較輕一些，還留在上清里面。,鎂離子可以穩(wěn)定細(xì)胞核,MgCl2。主要 有兩種成分，一個(gè)是10mM這種低滲buffer鹽濃度很低，所以由于滲透壓的影響， hela細(xì)胞膜會(huì)變得比較脆弱。據(jù)說這個(gè)公司有NIH的補(bǔ)貼， 所以價(jià)錢不貴。因?yàn)榧?xì)胞器官的分離的 方法已經(jīng)很成熟了。 這個(gè)純化步驟說明，不同的純化手段必須加以精心組合才會(huì)有最好的效果。column上的DNA這樣一來很多蛋白根本沒可能和AP1分開！這也就是為什么這一步純化倍數(shù)很小的原因。大概由于不是那么精細(xì)，所以可以自己手工裝柱，我們用的柱子是Amersham的XK26/40(,我們用的是Sephacryl比活力從510倍一下子提到了50~100倍。到這里比活力會(huì)增加到原來的2倍。另外就是，可以把這種特異序列的DNA固定在柱子上，然后做親合層析，純化效率會(huì)非常高。specific轉(zhuǎn)錄因子是極其重要的一類蛋白質(zhì)，真核生物的基因有5~10%是用來編碼這種蛋白的。Helix的一邊有很多Leu,和另一個(gè)helix形成Leucine或者是JunFos這個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)主要是要從Hela細(xì)胞里純化AP1。（十）40%到50%,50%,有一個(gè)很簡單的方法可以用來估計(jì)蛋白質(zhì)沉淀所需硫酸氨的濃度。Serumalbumin一起沉淀了。fluidsDr.蛋白質(zhì)在溶液里 面溶解度和鹽濃度有關(guān)系。我舉兩個(gè)例子把：TCA沉淀大家都熟悉的。由于不同的蛋白，在不同的硫酸氨濃度下被分 別沉淀下來，這種方法把蛋白質(zhì)樣品粗粗的分離一下。不常做生化的同學(xué)可能對(duì)硫酸氨沉淀的方法不熟悉。就可以清楚的看到RNA用低鹽buffer重溶沉淀的蛋白,過免疫親合柱就行了。這樣一來，好多垃圾蛋白和核酸都被去掉了。RNA（聚乙烯亞胺）。核心辦法是用免疫親合柱來純化。32可以和細(xì)菌體內(nèi)的CoreBurgess要我們作的另一個(gè)很重要的實(shí)驗(yàn)。而不是前面用的陰離 子交換柱呢？因?yàn)閟arkosyl帶負(fù)電，會(huì)與陰離子交換柱結(jié)合得很好。分離了出來。接著我們用PorosHCl溶解sigma32之后的重折疊，結(jié)果很糟糕。（八）”液體DEAE“ 這以后，他們表達(dá)的CDC6都有活性了，后來做了一系列的電鏡三維結(jié)構(gòu)重構(gòu)實(shí)驗(yàn)，研究CDC6和ORC的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。Stillman認(rèn)為谷氨酸根和磷酸根跟氯離子相比更接近與核酸,正當(dāng)他們滿心歡喜的以為問題解決了的時(shí)候，意外又出現(xiàn)了。然后呢，他們就想到了加一個(gè)GST首先他們嘗試真核系統(tǒng)來表達(dá)，但是意外的是，他們發(fā)現(xiàn)表達(dá)出來的CDC6完全沒有活性。復(fù)制的準(zhǔn)備工作就完成，只等其他kinase的激活，細(xì)胞從G1進(jìn)入S期，復(fù)制就開始。在G1期里面，CDC6這個(gè)蛋白會(huì)與ORC結(jié)合，同時(shí)讓MCM(DNA解旋酶)也裝載到ORC上,形成一個(gè)prereplicationorigin)，ORC(Originthe這個(gè)蛋白,我們的晚間報(bào)告有一個(gè)是他作的。Stillman（七）古怪的CDC6 purificationflask。如果有足夠氧氣在培養(yǎng)基里面,所以用這種培養(yǎng)基養(yǎng)菌，很省事，接種了第二天收細(xì)菌，提蛋白就行了。這種培養(yǎng)基含有成比例的glucose原來如此?。?！ 所以要解決我原來的那個(gè)問題，用一種不含有乳糖的media做培養(yǎng)板就完事了。由于milkstudier做報(bào)告之后，才真相大白。我當(dāng)時(shí)就懷疑是因?yàn)楸磉_(dá)的蛋白對(duì)大腸桿菌有毒性，僅僅是本底的一點(diǎn)表達(dá)就足以殺死細(xì)菌。大家可以想象，這種系統(tǒng)雖然很強(qiáng)大，但是表達(dá)量太大，對(duì)大腸桿菌有毒性，造成的結(jié)果就是大腸桿菌十分排斥表達(dá)蛋白的質(zhì)粒。的表達(dá)，就可以啟動(dòng)目的蛋白的表達(dá)。如果在細(xì)菌培養(yǎng)基里面加入IPTG,operon控制的T7polymerasepromoter來控制基因的表達(dá)。系列質(zhì)粒)的發(fā)明者。RNAStudier這老哥是Brookhaven（六）興風(fēng)作浪的乳糖(lactose) 的重折疊的效果都很好。最強(qiáng)的是TGE+35%platerglycerol,同時(shí)還試了TGE,賣的refolding然后把這些溶解的GFP溶液分到一個(gè)96孔板上,每個(gè)孔10微升，然后加入２０倍的refoldingbody)。 　為了讓我們對(duì)這個(gè)polymeraseBurgess有一次不小心出了錯(cuò)誤，把純化出來的RNA那時(shí)候一個(gè)大問題是RNA這個(gè)穩(wěn)定的效果是十分驚人的。NaClNaCl pHEDTA。盡管他吹得神乎其神，配方卻十分簡單。我們聽得都目瞪口呆。據(jù)他說，六幾年的時(shí)候他看到一個(gè)澳洲的老兄的一片文章,講述一種新奇的染料叫考馬市亮藍(lán),Burgess但我對(duì)她映象還是十分深刻，主要就是因?yàn)樗峭砼苤拥慕?jīng)歷?！?當(dāng)然最簡單的辦法還不是這個(gè)，最簡單的辦法的是把盛有洗液的容器放高，然后利用虹吸的原理讓液體源源不斷的流經(jīng)柱子。所以她每隔二十分鐘就去加洗液，所以白白花了好幾個(gè)小時(shí)。room。我原來很喜歡女生A,如果你嫌液體流得太慢（尤其是洗柱子的時(shí)候），可以在柱子下端出口連一個(gè)長的塑膠管子或者針管，這樣速 度會(huì)快很多。液體流經(jīng)柱子速度由hydrostatic比如他特別提到了disposablepressure和跑小柱子的trick 　　50陰離子交換柱，拿到的蛋白很少，回收率小于5%。Burgess臉色不好看，說不應(yīng)該這樣的。Burgess說的還真象那么回事，可事實(shí)上，嘿嘿。但是問題也是類似的。這個(gè)方法Burgess并不喜歡，因?yàn)椋肝鍪莻€(gè)緩慢的過程。body 　Burgess還要我們?cè)嚵私?jīng)典的sarkosyl(N十二烷基肌氨酸鈉）是一種比較強(qiáng)的陰離子去垢劑,相當(dāng)穩(wěn)定，不溶于triton,所以這一步，絕大部分垃圾就被去掉了。我們先用1%Sigma我們這個(gè)實(shí)驗(yàn) 的核心主角就是其中一個(gè)因子，叫sigma32。RNA（三）另外，他有兩個(gè)未成年的兒子，喜歡不斷打他手機(jī)。Severinov副教授，這老兄是俄羅斯人，這四位老師中最年輕的一位。 第四位教授是rutgers有一天那個(gè)博后指著這老兄的鼻子說，XXX呀，你把bench弄得太亂了，趕快給我清理干凈了。that這個(gè)老兄說看起來你丫沒這膽量，那還有第二種選擇，就是殺了你自己。有一天有一個(gè)學(xué)生向這個(gè)老兄投訴說和實(shí)驗(yàn)室另一人有矛盾。center的suehwa第三位教員是來自Texas 我知道后覺得特佩服，真正的科學(xué)家不應(yīng)該被自己過去所受的訓(xùn)練束縛死了，應(yīng)該是根據(jù)研究的需要隨時(shí)準(zhǔn)備學(xué)習(xí)新東西。Tjian這老哥研究果蠅的,教授。但是Burgess又承認(rèn)watson對(duì)他自己的學(xué)生很支持，很提拔，這幾年又盡心盡力為冷泉港籌 款，貢獻(xiàn)巨大。后來的有一天，我還真的看到了watson去找他聊天?，F(xiàn)在開始八卦一下幾個(gè)老師，^_^ 總負(fù)責(zé)人是來自wisconsinmadison的Richard來自Princeton的Adam,做海洋生物學(xué)的。學(xué)生則一共有16個(gè)，分成四組，輪轉(zhuǎn)式的做完四個(gè)模塊。 waiver。這是冷泉港享有盛名的最主要原因。torenown。Ad幾個(gè)大字。課程結(jié)束之后，每一個(gè)學(xué)員都有一份證書，印著Per 這一系列文章是我對(duì)這次上課經(jīng)歷的全面總結(jié)，一部分是八卦，一部分是流水賬般的記敘，還有一些是從這課程學(xué)到的tricks, 這本書深深的吸引了我，因?yàn)槔锩嬗涗浀膶?shí)驗(yàn)十分經(jīng)典，涵蓋了蛋白質(zhì)純化中可能用到的大部分手段，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)有十分詳盡的解釋。從純化到星辰CSH蛋白質(zhì)純化課側(cè)記Royluo 引子 　 2000年5月6日，我一個(gè)人在合肥三孝口書店閑誑,希望買點(diǎn)參考書帶出國去。我很快意識(shí)到，這本書實(shí)際上是冷泉港實(shí)驗(yàn)室開設(shè)的一門《蛋白質(zhì)純化與鑒定》實(shí)驗(yàn)課的教材。這是一個(gè)很模糊的想法，沒有想到的是，五年以后這個(gè)想法竟然實(shí)現(xiàn)了。 我來解釋一下標(biāo)題。AstraAsperasuffering值得一提的是，冷泉港有相當(dāng)多的培訓(xùn)班和會(huì)議，是一個(gè)科學(xué)家交流和學(xué)習(xí)的中心。二月份的時(shí)候的到消息，我被錄取了，并且還有1000刀的tuition欲哭無淚啊。每個(gè)老師都有一兩個(gè)助手幫忙。的chad,做有絲分裂的。 他六十年代是watson的博士后，watson似乎跟他關(guān)系很好，每年純化課的時(shí)候，watson都會(huì)跑到培訓(xùn)班的實(shí)驗(yàn)室找Burgess聊天，同時(shí)拉他去吃飯什么的。連Burgess教授一次和我們吃飯的時(shí)候都承認(rèn)，watson有時(shí)候口無遮攔，讓他都覺得很難堪。Courey詢問這個(gè)課的情況，而他也鼓勵(lì)我申請(qǐng)。原來這老哥博士是做生化，博后跟的是robert他那時(shí)侯不懂果蠅的遺傳學(xué)，完全靠自學(xué)和到處問人。我還跟他就ipod聊了一陣子，因?yàn)槲乙灿袀€(gè)ipod。cancer一個(gè)笑話是這樣的,那個(gè)學(xué)生聽了之后，差點(diǎn)倒了。就是ignorelin的 博士后老板雖然當(dāng)了老板，但是還是喜歡做實(shí)驗(yàn)，并且和一個(gè)博后共用一個(gè)bench。這老美連三八線都出來了。的konstantinKonstantin特搞，有一次他做報(bào)告，他的電腦的桌面上有一堆亂七八糟的文件夾，其中有一個(gè)竟然是divorce!我告訴坐我旁邊的一個(gè)老美，老美說也注意到了，認(rèn)為實(shí)在是很sad，呵呵。舔犢情深，可見一斑。并且與核心酶結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄。genes的啟動(dòng)子。 所有的buffer幾乎都已經(jīng)配好了，所以直接做就行了。body用什么好呢？Burgess教授提到了sarkosyl。所以用sarkosyl做重折疊之前的變性劑是再好也不過的了。inclusion怎么做呢？方法有很多種，最簡單的是透析，把變性劑全部換掉。另一種方法是突然稀釋變性的蛋白，由于蛋白濃度相對(duì)與透析低了很多，好一點(diǎn)。由于燒杯里的溶液蛋白量是逐漸增加的，所以一開始蛋白折疊中間產(chǎn)物能夠相互作用的幾率大大降低了。一開始還好，滴到后來，溶液就變渾濁了，最后幾乎成了沖淡了的牛奶那樣的東東。HQ（四）Hydrostatic假定我們對(duì)蛋白質(zhì)純化一無所知，所以講得很細(xì)致。唯一的問題是，由于是依靠重力跑，速度有時(shí)候會(huì)十分慢。pressure又是由實(shí)際柱高(即液體經(jīng)過的長度)來決定。 　　我知道一個(gè)例子。這個(gè)過程中，她好像沒什么事情，但是每隔20分鐘，她就會(huì)去一次cold稍微多了一點(diǎn)，速度很慢，而protocol有一步要求用數(shù)百毫升的洗液來沖洗柱子。只要在下端出口加一個(gè)長管子，她至少可以少等兩個(gè)小時(shí)。 　我現(xiàn)在跟A已經(jīng)完全沒有來往了,Dr.blue染蛋白膠的人。所以他就寫了一封信要了一些，結(jié)果效果奇好?？梢哉f到了包治百病的神奇地步。和Tris50mMEDTA很多蛋白，尤其是酶會(huì)十分穩(wěn)定。polymerase的各個(gè)亞基。過30分鐘，活性還會(huì)損失一半。結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)，RNA也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有好處。他之前已經(jīng)準(zhǔn)備好了在大腸桿菌中表達(dá)的GFP包涵體(inclusion(N十二烷基肌氨酸鈉）溶解變性。我們有一個(gè)hampton我們?cè)嚵怂羞@些bufferTGE+35%由于GFP折疊好