【正文】 了才能發(fā)熒光，用一個fluorescence相比之下，TGE的四種溶液都很好，GFP重折疊的效率是hampton kit的幾十倍。HC變性還是用sarkosyl來變性，TGE+glycerol很多kit吹得很牛，但并不一定真的好用。本來這個報告是后來才聽到的，但是由于Burgess的模塊是唯一的涉及大腸桿菌鐘表達(dá)蛋白的，我把這一段提前來說說。噬菌體，也是T7system(pET長話短說，pET系列的質(zhì)粒都用T7RNApromoter和lac基因片斷。polymerasepolymerase工作起來非常有效率，效率高到什么地步呢？就是表達(dá)一個蛋白，表達(dá)量可以占到大腸桿菌總蛋白量的50%!妖怪的是，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)菌株BL21(DE3)怎么也不能轉(zhuǎn)化，鋪的板一個菌落也沒有。這個問題到了billTryptone是caseine的酶解產(chǎn)物，而casein又是milk里提取而來。studier研究發(fā)現(xiàn)即使很微量的lactose也能有效的誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。studier根據(jù)這個特點研究出一種可以自動誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。細(xì)菌首先攝取glucose，不攝取lactose,當(dāng)細(xì)菌長到一定密度，耗完glucose之后，就開始攝取lactose,從而開始誘導(dǎo)表達(dá)。氧氣是限制細(xì)菌生長最重要的瓶頸,翻十倍到20~30!要提高培養(yǎng)瓶的供氧，可以用baffledand(2005) 　　Bruce他是澳洲人，在美國待了N年，卻從沒有加入美國國籍，所以他只是外籍院士。在報告里面，他特別提到了表達(dá)純化CDC6蛋白的經(jīng)歷，我覺得十分有意思。in真核生物的DNA有多個復(fù)制起始位點 (replicationORC在整個細(xì)胞周期里面都是與DNA結(jié)合的。這個plex一旦形成，DNA但是到了CDC6，他們碰到了大麻煩。然后他們嘗試在室溫下誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)蛋白雖然可溶了，但是都被降解了。所以呢，他們重新做了一個construct,在GST和CDC6序列中間加了一個蛋白酶切割位點。他猜到這個蛋白可能很不穩(wěn)定，對緩沖液要求可能很高，所以他讓一個本科生連續(xù)試了十多種buffer，最后發(fā)現(xiàn)如果用磷酸鉀＋谷氨酸鉀緩沖液，切掉GST之后CDC6就不會沉淀了。卻就這一點小trick! 試Gudn效果好了很多，至少沒有渾濁現(xiàn)象了。50，一種陽離子交換柱，來把可溶的sigma50 　　好了，聊完離子交換柱，現(xiàn)在回到Dr這些可溶的sigma我們這個實驗就是要把這個復(fù)合體純化出來。是什么呢？就是polyethyleneimine由于這種結(jié)合是受離子強度影響的，感覺上很象DEAE那之類的性質(zhì)，所以Burgess稱之為液體DEAE。然后再用高鹽洗脫蛋白質(zhì)，而DNA和PEI結(jié)合很緊密，所以還是在沉淀里面。所以下一步就是用硫酸胺沉淀的辦法把蛋白和PEI分開。blue沉淀，沉淀，沉淀 上一部分我匆匆提到了用硫酸氨沉淀來去掉PEI(Polyethyleneimine）的步驟。 硫酸氨沉淀是怎么做的呢？其實很簡單，把磨細(xì)了的硫酸氨粉末往樣品溶液里 倒就行了，蛋白就會相繼沉淀下來。 其實沉淀蛋白質(zhì)的方法有很多種，但是對于嬌貴的蛋白質(zhì)來說，很多常用方法 都太harsh了。 out）。 硫酸氨如果運用的好可以幫很大的忙。這個公司是做單抗的，有一個工序是要從ascitesBurgess很驚訝的發(fā)現(xiàn)，這個公司竟然沒有做仔細(xì)的分析，就隨便用了一個很高的硫酸氨濃度，結(jié)果把抗體和serumalbumin分開。因為是否能沉淀下來跟蛋白質(zhì)濃度有關(guān)系，而每次樣品內(nèi)目標(biāo)蛋白的濃度不一定一樣。40%,30%到40%,看看目標(biāo)蛋白到底在 哪里，就完事了。Courey。AP1其實不是一種均一的蛋白質(zhì)，實際上一種二聚體結(jié)構(gòu)，要么 是JunJunhelix的結(jié)構(gòu)。 　sequence決定了這個，才能有一個活性檢測系統(tǒng)，才能真正開始純化。因為無法沉淀而被去掉。column,值得一提的是這個凝膠過濾層析。凝膠(一種聚 丙烯酰胺凝膠)，這種凝膠分辨范圍大概是10KDa到幾千KDa，但是這種凝膠是比較粗的一種介質(zhì)，分辨率不能跟superdex之類的比。volume）相差挺小，而AP1只有40~50KD已經(jīng)很小了。column,column，影響要轉(zhuǎn)錄因子的純化。從天然產(chǎn)物中純化蛋白，如果大概知道蛋白在什么細(xì)胞器官，把 細(xì)胞器先分離出來作為純化的起始原料，可以省好多事情。買來的。然后用 一種低滲buffer來重懸細(xì)胞。低滲buffer里頭雖然鹽濃度很低，但也不是沒有鹽在里面。就關(guān)鍵多了。細(xì)胞膜破碎之后，細(xì)胞核還是基本完整的，細(xì)胞質(zhì)里面ER細(xì)胞核是比較重的，所以一離心，馬上就沉淀下來了。有些細(xì)胞器，比如要把Golgi和ER分開，是個十分麻煩的事情，因為比重相差太小了。WR1339。所以下一步就是用高鹽buffer(我們要的轉(zhuǎn)爐因子就在這里面。我們又做了一步硫酸氨沉淀，histone由于太小，沉淀不下來，而轉(zhuǎn)錄因子什么的都可以被沉淀下來。S300chromatography)， 我感覺還是很激動的。我先來談?wù)?原理把。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品經(jīng)過這些微珠的時候，如果蛋白質(zhì)分 子體積太大，不能通過微珠的孔狀結(jié)構(gòu)，就會繞過微珠，很快的被洗脫下來。column分開。filtration這個特點的一個好處是，所有的蛋白樣品 最后都能被洗脫下來，柱子重復(fù)用也不會有什么問題。由于蛋白在gel但是由于蛋白峰太寬，重疊在一起，這樣就很難分干凈。有一次一個師妹遇到了一個難題，表達(dá)一個GSTtagged的蛋白 有一個降解產(chǎn)物。filtration。用別的方法解決了這個問題。就柱子的材料而言，最主要的就是得把微珠做小一些，這樣空體積就會小一些，擴散就不會那么嚴(yán)重。另外分辨率好的柱子往往不能手工裝，得買預(yù)裝的柱子，這樣就很貴（很貴很貴?。。。iltration我們用的是Amersham 的的resin。我們這一組人中，我負(fù)責(zé)裝柱子。我過去裝柱子犯傻，不知道要這么做，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下面的resin然后就是等了，等resin我第一次做沒經(jīng)驗，費了九牛二虎之力才搞定了。隨著柱面的下降，接頭裝置還得不斷往下移動，使得接頭剛剛好與柱面接觸。所以呢，首先得測試這個柱子是否真的裝好了。跑藍(lán)色葡聚糖可以起到三個目的。特定蛋白在柱子的洗脫體積與空體積的比值是一定的，所以只要知道了空體積，就能知道蛋白大概會在什么時候洗脫出來。一般來說呢，柱子下端堆積會比上端均勻，為了分辨度好，應(yīng)該從更均勻的一端上樣。monitor加記錄儀。column。買來CNBR活化好的agarose，然后讓特定序列的寡聚核苷酸固定上去就行了，柱子也是最簡單便宜的一次性柱子。當(dāng)時是在NIH的Anfinsen實驗室。他實驗室那時侯有一個學(xué)生一個project是從葡萄球菌里面提取大量核酸酶，然后研究enzyme/inhibitorionexchange,cloning搞笑的是，anfinsen自己很懷疑這個技術(shù)是否能work, 　　八卦完歷史，現(xiàn)在介紹一下親合層析的種類。Chromatography)和IAC(Immunological proteinAEGF repeats。決定了ligand之后呢，就得考慮怎么把ligand偶連在beads上了。imido,如果要偶連的蛋白沒有l(wèi)ysine用這種偶連方法就不好。amine都要形成氫鍵。resin,filtration，用的是Amersham賣的Superose無論是sephacryl分出來的組分還是DNA足跡分析assay)，都可以用來分析蛋白與特定DNA的結(jié)合能力。assay然后把膠拿去做放射自顯影就行了。plug，就是配少量gel溶液，然后加過量的TEMED，然后迅速加到玻璃板中間，這些膠還沒漏完就會凝固，所以會封住底端。是這樣的，由于膠的濃度低，比較脆弱，另外尺寸比較大。一下，使得這一面比較疏水，就不會與膠粘在一起了。陽性對照很簡單，是看看系統(tǒng)能不能work。plex,在膠看起來就是探針的遷移率進(jìn)一步降低了。如果加入完全同序列的競爭DNA可以削弱proteinDNA MobilityshiftfootprintingII無法酶切那一部分，我們看到的ladderIstock 這東東比較粘稠，為什么要加它呢？大家想想看，用來做DNAase的樣品都是通過跑柱子的fractions，轉(zhuǎn)錄因子必定是被稀釋得很厲害的。探針stock酶切。第二步是加DNase我們是三個三個一做,可能是太緊張了把，我們連犯了兩次錯誤，漏加了Ca/Mg，只得重做幾個樣品。全體成員放假一天休息，而放假前一天晚上也沒有報告。第二天 早上，第三個模塊的實驗開始了。主要是因為這是唯一一個設(shè)計膜蛋白純化的實驗，而膜蛋白純化是所有蛋白質(zhì)純化中最麻煩的一類。相比之下有些受體就不那么好伺侯了，比如我研究的Notch受體，配體也是膜蛋白，Notch和配體必須都簇集在細(xì)胞表面或者固體表面才能有接合，溶液中的游離狀態(tài)下根本沒法相互作用。assistant首先是把大鼠肝臟的質(zhì)膜部分分離出來，然 后呢用去垢劑溶解一下，用凝集素層析來粗分一下組分，然后做受體測活與鑒定。chromatography來精制一下的。in其它的膜結(jié)構(gòu)中呢，線粒體是最重的，質(zhì)膜由于有膽固醇成分，所以是最輕的。差速離心（differential第一次是低速離心，只用600g，這么小的離心力下，只有未破的細(xì)胞和細(xì)胞核才會沉淀下來。去上清進(jìn)行第三次離心，這回離心力比前一次又要大一個數(shù)量級到了十萬g。但不管是什么分離方法，本質(zhì)上都不完美，千萬不要指望從某篇文章找到一個方法就能套用。我們一組四個人，每人都分了一個新鮮冰凍的大鼠肝臟（解凍后很難聞），然后就是拿刀片剁啊剁。我們把勻漿用兩層cheese然后再把pellet轉(zhuǎn)移到Dounce勻漿器再弄均勻了。我們首先往pellet這個折射儀看起來很粗糙，但是卻十分好用。這層質(zhì)膜看起來有點像果凍，可以用小勺舀出來。最主要的問題是：用什么去垢劑呢？，純化完之后再比較不同去垢劑的蛋白質(zhì)純化效率，看看哪一種去垢劑最有效。我們這一組人選的四種去垢劑分別是:Cholate,我選的是Octyl這里就權(quán)當(dāng)拋磚引玉了。X100或者NP40)。比如CHAPS比如Triton 它們實際上是同一種去垢劑，疏水基團(tuán)是取代苯基，而親水基團(tuán)是聚乙氧乙醇基團(tuán)。X100都是小包裝，而且在包裝瓶子里面充有惰性氣體。X100之類的去垢劑有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，所以在280nm有很強的吸收。比如常用的Bradford這種染料在酸性條件下呈現(xiàn)為褐色膠體物質(zhì)，但在與疏水物質(zhì)結(jié)合之后會變得穩(wěn)定而呈現(xiàn)藍(lán)色。cholate對Bradfordglucoside基本上沒有什么干擾。因為很多去垢劑會形成膠束結(jié)構(gòu)，分子量非常大，所以沒法用簡單的透析或者超濾來去掉。所以膠束的分子量有87KD了,這顯然是沒有辦法用透析來去掉的。所以如果要用到離子交換柱，要用非離子型或者兩性離子型的去垢劑。(4)如果在后續(xù)步驟中選用凝集素層析,Glucoside的去垢劑，親水基團(tuán)是糖或者糖的衍生物，有可能與凝集素結(jié)合，降低凝集素的純化效果。如果此時用Octyl glucoside，就無法純化蛋白了，因為Octyl比如Sodiummembranephase這種方法叫做，tworeceptor。protein但是，我覺得大家至少得意識到，去垢劑很有可能干擾蛋白活性的。Omannosyltransferase很多實驗室都懷疑這種蛋白是糖基轉(zhuǎn)移酶，但是很長一段時間里面，很多實驗室發(fā)現(xiàn)表達(dá)的重組蛋白都沒有活性。X100和NP40是很常用的去垢劑。thioglucoside就有活性了！所以呢，如果大家試圖表達(dá)一個膜蛋白，卻沒有活性，不妨換一下去垢劑，說不定會有意外的驚喜。Aglutinin(WGA)現(xiàn)在常用來做蛋白質(zhì)純化的凝集素絕大部分是從植物中提取出來的。的糖基修飾。注意，只能是部分提純，凝集素層析并不能一步登天，讓蛋白質(zhì)比活力一下子提高上千倍，至多幾十倍就已經(jīng)很不錯了。glycans。domain,lumen，同時就會被加上一整個樹枝狀的Nglycan 但是Nglycan的“主干”都是相似的.\Man/GlcNAcGlcNAc在這種Nglycan的末端有很多甘露糖(mannose)修飾。分泌出去的蛋白，或者已經(jīng)到細(xì)胞表面的膜蛋白的Nglycan往往是plexNglycan的末端往往修飾有Sialicacid溶液。胰島素受體不是酶，所以測活是利用胰島素與受體的特異結(jié)合。Glycol是這樣的，她實驗室發(fā)現(xiàn)了一個蛋白質(zhì)因子首先一步呢，就是得有一個測活方法。結(jié)果呢，這個測活試驗完全失敗了。這就是為什么insulineLin發(fā)現(xiàn)的MDABF1因子，分子量相對insulin大了好多，有50多KD，所以游離的因子也能被PEG沉淀下來。一定得搞清楚原理是怎么回事，這樣出了問題才知道怎么去改進(jìn)。 其中她重點談到了MDABF1這個因子。這個bindingcolumn來分開，每做一次assay都很麻煩。另外一種可能性是:需要強調(diào)的是，蛋白質(zhì)純化絕對不是萬能的。這一個模塊的純化試驗到此就為止了。Octyl原始的實驗手冊上還有進(jìn)一步的insulin比如一個實驗是從SF9里面純化一個hisgel。純化胰島素受體的模塊結(jié)束之后，我們這一組人進(jìn)入到最后一個模塊，做鈣調(diào)蛋白的純化和分析。nucleotidephosphatases不過我對這個模塊的實驗經(jīng)歷并不是很滿意。　　整個純化步驟大概是這樣的。然后再過陰離子交換柱DEAEblue都可以染出來。然后才能逐漸制定最優(yōu)化的純化策略。(2)生物活性不會因為透析而丟掉(3)Urea之類的變性劑是否降低生物活性(4)對化學(xué)修飾劑(比如sulfur我們提取鈣調(diào)蛋白所用的組織原料，雞胗，量挺大的，有一斤之多，紅紅的一大堆肉