【正文】 通用的親合層析包括IMAC(Immobilizedbeads 之類的東西， 幾乎所有人都會(huì)用到。 carbonate的中間產(chǎn)物,DNA的primary 了解一些基本的偶連方法的化學(xué)原理是很有用的。6預(yù)裝柱子。(DNase原理很簡單，把蛋白質(zhì)樣品和P32標(biāo)記的寡聚核苷酸探針 一起孵育十幾分鐘,這是一個(gè)小竅門，據(jù)instructor這樣打開膠夾層的時(shí)候,膠只會(huì)緊緊貼在一面玻璃上面，把膠和這整塊玻璃拿去放射自顯影就行了。這叫supershift。assay就會(huì)空缺一部分。solution里面除了探針以外，還加了非特異DNA,類似于poly(dIdC) poly(dAdT)之類的東西。足跡實(shí)驗(yàn)最關(guān)鍵的就是要保證樣品蛋白和探針有充分的結(jié)合。我們這一組里，我和丹麥女生負(fù)責(zé)做酶切，這個(gè)酶切可是把我們忙壞了。每20秒加一個(gè)樣品,我學(xué)校離CSH很近，索性晚上就溜回去了，順便還把YL硬拉出來聽我匯報(bào)學(xué)習(xí)心得，呵呵。受體蛋白純化尤其麻煩，往往可能找不到又快又準(zhǔn)確的測活辦法。professor。但是最近好多年，很多學(xué)員更希望做一些重組蛋白純化的實(shí)驗(yàn)，所以就把原來的實(shí)驗(yàn)給切短了。這兩種膜結(jié)構(gòu)也是很好分開的。細(xì)胞主要的膜結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞質(zhì)都還在上清里面。最好的辦法是利用細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)特征性的一些標(biāo)記物（比如plasma弄碎了之后就加一種低滲緩沖液，再把碎的肝臟和緩沖液倒到Dounce勻漿器里面做勻漿。下面就開始準(zhǔn)備蔗糖梯度離心(sucrose下一步呢，就是把加了蔗糖的勻漿轉(zhuǎn)移到超速離心管里，%的蔗糖溶液，接著就是超速離心兩小時(shí)（九萬g）。TritonGlucoside。去垢劑的親水基團(tuán)一般有(1)羧酸基團(tuán)，比如膽酸鈉(sodiumX100和NP40。選擇適當(dāng)去垢劑來純化膜蛋白，有一些實(shí)際問題必須先想好。assay，用的是massieassay比如大家常用的Triton另外，由于去垢劑有疏水基團(tuán)，一般用了去垢劑之后，就不應(yīng)該在后續(xù)步驟里采用疏水作用層析的方法了。選用的去垢劑是否構(gòu)成干擾？凝集素是一種植物中提取的一系列可以與糖基結(jié)合的蛋白。glucoside的親水基團(tuán)是一個(gè)glucose。prep,phase5:1的比例加去垢劑。1這個(gè)成功的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，如果用常規(guī)濃度下的Triton（十八）凝集素層析絕大部分膜蛋白的extracellular但盡管如此，凝集素層析是一種很好的辦法，因?yàn)閎uffer條件非常溫和，洗脫液是加了糖的buffer，透析什么的也方便，非常非常適合于和其他層析方法偶連起來用。上面。core。type。最后需要指出來是，純化一種特定蛋白，選擇用什么凝集素是完全經(jīng)驗(yàn)性的，需要提前測試才知道的。具體的測活步驟非常簡單，就是把I125標(biāo)記的胰島素和純化的組分混合然后孵育一段時(shí)間。MDABF1。問題出在PEG沉淀這一步。聽完這個(gè)小插曲，我感覺挺吃驚，作為一個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的教授， 她實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在正在做的是試圖用蛋白質(zhì)純化的辦法來找出MDABF1的受體。我個(gè)人覺得這個(gè)方法不是很明智。要想純化出一個(gè)未知蛋白，最最重要的是要有一個(gè)簡單明了直接的測活方法。Glucoside都還比較好，Sodiumtag的蛋白amp。就這樣，第三個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)結(jié)束了。鈣調(diào)蛋白(Calmodulin)十分重要，幾乎在所有真核細(xì)胞里面都能找到。和ATPase等等。首先把雞胗剁碎勻漿，然后做粗分離，用硫酸銨沉淀的辦法把雜蛋白都沉淀下來。我們做的實(shí)驗(yàn)中沒有對Calmodulin的測活實(shí)驗(yàn)，可能是因?yàn)樽詈蠹兓鰜淼腃almodulin很多,可以做光譜分析之類的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，所以就省掉了。hydryl(1)對protease的是否敏感。純化出來的組分再過疏水作用層析柱，就可以得到很純的Calmodulin了，用Commassie我起初對他印象不佳，后來發(fā)現(xiàn)這個(gè)人其實(shí)很nice,非常和藹。kinases,（二十）鈣調(diào)蛋白而我最后選擇去跑了一個(gè)2D而教員為了滿足很多學(xué)生做做重組蛋白表達(dá)純化的愿望，用一些比較白癡的的實(shí)驗(yàn)取代了原有很經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)。CHAPS,assay的測活方法雖然可以找出與MDABF1結(jié)合得最好的膜蛋白，但是找出的膜蛋白可能根本沒有信號傳導(dǎo)的功能。filtration 講述她的研究進(jìn)展。而Dr.其中連PEG沉淀都是一樣的。說到PEG沉淀。拿到洗脫的蛋白之后，我們就著手開始測活，分析純化的效率和倍數(shù)。acids，所以特別適合于純化這種類型的蛋白，洗脫液可以用GlcNAc和Sialicalphaglucose和alphaGlcNAc,所以可以這三種糖溶液來做洗脫液。|膜蛋白的新生肽鏈在被翻譯合成的同時(shí)會(huì)被直接塞入ER 這種糖基是加在膜蛋白的extracellularagarose可以部分提純膜蛋白。WGA是凝集素(Lectin）中的一種，而Lectin指的是可以與糖基結(jié)合的蛋白質(zhì)。Triton有一種酶叫Protein:這樣呢，就可以把膜蛋白和可溶蛋白分開。但是可是用來處理plasmatype　Nglycan的蛋白質(zhì)，與mannose和glucose都能結(jié)合。(3)是否需要在以后的步驟里面用到離子交換層析或者疏水作用層析？離子型去垢劑會(huì)與相應(yīng)離子交換柱結(jié)合得很好，干擾蛋白質(zhì)的純化。(2)是否需要在以后的步驟里面去掉或者置換掉去垢劑？去掉或者置換掉去垢劑是一件很麻煩的事情。X100和sodiumassay。所以一般商業(yè)化的,比較純的NP40和Triton(4)聚乙氧乙醇基團(tuán),去垢劑的疏水基團(tuán)一般是下面三種(1)直鏈或者支鏈烷基結(jié)構(gòu)(2)類固醇之類的多元環(huán)結(jié)構(gòu)(3)取代苯基結(jié)構(gòu)(比如大家常用的Tritonglucoside。所以，只能具體問題具體分析，一個(gè)一個(gè)去嘗試。我們有一個(gè)折射儀，可以很快的測出溶液的折射率以及對應(yīng)的蔗糖濃度。拿出離心管一看，果然有一個(gè)很松的pellet，包括了質(zhì)膜，細(xì)胞核之類的東西。這種方法對于分離 大鼠肝臟質(zhì)膜比較管用，對別的組織就不一定好用了。下一步的蔗糖梯度離心就要精細(xì)得多。首先用等滲緩沖夜來做組織的勻漿，然后就開始離心。其中核膜是最容易的，因?yàn)榧?xì)胞核很重，稍微離心一下，就沉淀下來了。affinity另外她的助手是一位臺灣的中年婦女，在SueHwa 實(shí)驗(yàn)室做research四個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)之中，我最喜歡這個(gè)模塊。這個(gè)培訓(xùn)課兩星期的課程也進(jìn)行了一 半。第三步是加反應(yīng)中止液。Iassaysolution。但是，如果有蛋白與特定區(qū)域相結(jié)合，DNaseI效果挺驚人，僅僅是兩個(gè)nucleotide和探針不一樣，競爭DNA探針就沒 法work了。做法很簡單，就是蛋白質(zhì)和探針孵育的同時(shí)加入抗那種蛋白的抗體，抗體識別蛋白質(zhì)之后會(huì)形成更大的protein成分是氯化有機(jī)硅氧烷)instructor先做一個(gè)gelMobilityshift方法呢就只有兩種，一種是凝膠遷移率變動(dòng)分析(EMSA)，另一種是DNA水解酶Ichromatography之后我們又跑了一個(gè)更精細(xì)的 Gel這是一個(gè)小竅門，但是給我們的一個(gè)啟示是，要做好affinityamine主要來自于lysine,原理很簡單，CNBr的碳對beads上的羥基發(fā)起親電進(jìn)攻，產(chǎn)生一種叫cyclic所以呢，在做親合層析之前，一定要根據(jù)蛋白質(zhì)本身的特點(diǎn)來選擇相應(yīng)的ligand。這些東東 大家應(yīng)該都熟，類似于Ni beads ,從此以后，各種各樣的親合層析層出不窮，成為生物實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)純化的最主要工具。有人可能會(huì)問，然后用 Ni beads純化啊？答案很簡單，那個(gè)時(shí)候根本沒有molecular的變性和重折疊證明氨基酸序列就可以決定蛋白質(zhì)最后的三維結(jié)構(gòu)。column雖然很重要，但是這一步技術(shù)上來說要求很低。首先是蠕動(dòng)泵，然后是柱子，然后是UV因?yàn)槊看窝b柱子，實(shí)際resin的總體積都會(huì)有微小的不同。為什么呢？因?yàn)檫@種柱子的質(zhì)量必須很好才能起到分離蛋白的效果，否則是根本沒法work的。這個(gè)過程最麻煩了，主要是不能引入氣泡，所以先得讓這個(gè)接頭裝置里面充滿緩沖夜，把氣泡趕出來。但是呢，有一個(gè)小竅門，就是必須先封閉柱子的下出口，往柱子里面倒10%體積的buffer。HR雖然gel如果要想蛋白峰寬度變窄一點(diǎn)，怎么辦呢？就樣品而言，體積越小越好，理想狀況是小于柱體積的２％。filtration, 說一件我的糗事。分辨率包括兩個(gè)因素，一個(gè)是兩個(gè)蛋白峰的距離，另一個(gè)是，蛋白峰的寬度。Gel這些微珠呢，并不是 實(shí)心的，而是有很多孔狀結(jié)構(gòu)。filtration的柱子了。再一離心，取上清就行了。一種辦法就是往一堆無辜的耗子注射一種特殊的去垢劑叫Triton然后再來一個(gè)低速離心。MgCl2勻漿器處理一 下,把細(xì)胞膜弄破。我們在這個(gè)模塊用的細(xì)胞都不 是自己長的，而是直接從一個(gè)公司Biovestaffinity裝好的柱子分辨率真的是很低，AP1的洗脫體積跟空體積(void H1)這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子看起來就象一雙筷子夾著DNA。specific轉(zhuǎn)錄因子，在很多生理過程里都有作用。60%到70%，離心保留沉淀，然后分析沉淀里的蛋白,30%,albumin沉淀下來，從而把抗體和serum他有一年去 一個(gè)公司做sabbatical。硫酸氨沉淀的機(jī)理是什么呢？簡而言之就是鹽析（salt 丙酮沉淀，通過改變介電常數(shù)來降低蛋白質(zhì)的溶解度，從而沉淀，由于丙酮一類的 有機(jī)溶劑可以與蛋白質(zhì)的疏水表面相互作用，所以沉淀的同時(shí)，蛋白質(zhì)也會(huì)變性。說實(shí)話我過去也很少接觸，但是在這個(gè)課里面，四組實(shí)驗(yàn)中有 三個(gè)都用到了這個(gè)方法，可見其重要性。最后結(jié)果很不錯(cuò)，跑膠后用coomassiepolymerase+sigma32都沉淀了下來。PEIbody,但是也有一部分 是可溶的。HS步驟和前一個(gè)類似，只是這一次是突然稀釋至25倍體積。大家等著看把。%$^!!! 幾乎是山窮水盡了，但是做這個(gè)project的博士后還是沒有放棄希望，他做了最后的孤注一擲。首先發(fā)現(xiàn)37度誘導(dǎo)表達(dá)出來的蛋白不溶，重折疊也沒有用。plex。 CDC6是干什么的呢？這要從ORC說起。這是一個(gè)到現(xiàn)在為止都沒有完全弄明白的領(lǐng)域。　這里再給大家講一個(gè)在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)的例子，一個(gè)很夸張的例子，但是很有啟發(fā)性。Expression2~3lactose。Bill雖然當(dāng)時(shí)我懷疑過本底表達(dá)是罪魁禍?zhǔn)?，但是我沒有仔細(xì)想過本底是怎么 來的。RNApolymerasepromoter只能被T7inductionStudier的報(bào)告。 另外，不論是用Gudnglycerol,這四種buffer。solution。hydrochloride（鹽酸胍）溶解變性，另一部分用sarkosyl穩(wěn)定到什么程度呢,就是你把這個(gè)酶加上50%glycerol，用平信從美國寄十幾天到澳洲，活性還有7~80%！另外Burgess也提到，如果要保存的蛋白有二硫鍵，加一點(diǎn)DTT，防止蛋白形成非天然的二硫鍵,放冰上,有了這個(gè)glycerol,5%50mM glycerolblack靈敏十倍以上。（五）萬金油buffer 　有簡單的辦法可以讓柱子跑得快一點(diǎn)的。這一等不得了，從晚上七點(diǎn)等到了凌晨一點(diǎn)。而hydrostaticBurgess剩下的上清跑了一個(gè)Poros就是放一大燒杯的緩沖液，里面有一個(gè)磁石可以不斷混合液體，然后一滴一滴加入變性的蛋白溶液。然后我們得去掉變性劑，做重折疊。sarkosyl的優(yōu)點(diǎn)是，雖然在高濃度下有變性作用，低濃度下卻對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定的作用。來溶解細(xì)菌本身的一些蛋白，inclusionshock　polymerase。后來發(fā)現(xiàn)此人相當(dāng)nice。哈哈哈。這老兄一看樂了，然后說你既然沒種殺人或者自殺，就剩第三種選擇了,她是一個(gè)身材瘦小的中年婦女，臺灣人，特搞笑，非常喜歡給我們講她博士后老板的笑話。后來做了faculty之后，決定用果蠅做模型來研究轉(zhuǎn)錄因子。申請這個(gè)課前，我先跟他發(fā)過watson此人口碑很不好，很自大。Boulder老板人很nice,但是他實(shí)在沒錢了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解決了，去年的退稅就這樣全搭進(jìn)去了,每年都是四月初開始，持續(xù)兩個(gè)星期。意思是throughAd想到哪說到哪，文字挺松散的，見笑了。而且當(dāng)時(shí)就動(dòng)了上這門課的念頭。我注意到有一本翻譯過來的書，書名叫做《蛋白質(zhì)純化與鑒定實(shí)驗(yàn)指南》。 這是拉丁語，直譯就是“從純化到星辰”。所以“從純化到星辰”實(shí)際的意思是，做好蛋白質(zhì)純化，以后就容易出人頭地。 　2004年底,　四月五號下午我趕到冷泉港，辦完登記手續(xù)后被告知晚上七點(diǎn)全體開會(huì)，與教員和同學(xué)見面。Chad和Adam都是博士后。Burgess教授, 　第二位教員是來自UCLA但是他卻負(fù)責(zé)教一組純化轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)驗(yàn)。這老哥雖然不是最年輕的，但是卻很能跟上年輕人的潮流，比如他說他有一個(gè)ipodMD這個(gè)老兄想了想，然后一本正經(jīng)的說，和人產(chǎn)生矛盾了，一般有三種選擇。guy!!!哈。結(jié)果他常常講實(shí)驗(yàn)講到一半就得停下來接電話。polymerase 核心酶是一個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體，只有合成RNA的活性，卻沒有識別DNA的能力。32過表達(dá)在大腸桿菌里面的時(shí)候，絕大部分形成了不溶的包涵體(inclusion 下一步就是用變性劑來溶解inclusionGudn在透析袋里面，蛋白的濃度還是很高。我們先用試著重折疊Gudn失敗啊。column的用法。這是很簡單的小trick,作完實(shí)驗(yàn)了之后，我好奇的問她，到底是什么試驗(yàn)花了這么長時(shí)間，結(jié)果她說她在用一個(gè)disposable同時(shí)，柱子的下端連上塑膠管，彎成一個(gè)連通器，這個(gè)連通器的高度應(yīng)該略高于柱面，這樣沖洗結(jié)束后，柱子就不會(huì)干。這人特有意思，喜歡吹噓他發(fā)現(xiàn)的小trick。 　不過Burgess最自豪的，還是他的“萬金油”buffer。配方是這樣的: 六十年代的時(shí)候，他還是個(gè)小博士后，在watsonpolymerase和g