【正文】 是Billglycerol。TGE+45%試劑盒，內(nèi)有十幾種不同配方的refolding我們把包涵體分成兩部分，一部分用guanidinium變得十分十分的穩(wěn)定。polymerase純化出來后十分不穩(wěn)定,這三樣都沒什么，真正關(guān)鍵的是5%glycerol。這個buffer叫TGE,就是Tris,比當(dāng)時流行的染料amido話撤遠了，現(xiàn)在再回到蛋百質(zhì)純化課。我聽了之后都要ft了,沒想到她們實驗室竟然沒有人告訴她,有一天晚上主動等在她實驗室等她做完實驗，就開車送她回家。pressure(靜流體壓力）來決定。Dr.我們一離心，沉淀出來一大堆不溶解的蛋白。Burgess提議用逐步滴加稀釋的辦法。在這兩種變性劑下很容易就溶解了。%的濃度就可以讓包涵體溶解。TritonSigma32可以識別heat不溶的sigma32 　　四月六號早上，我們開始了第一模塊的實驗，Burgess教授負責(zé)。此君滿頭亂發(fā)，一臉大胡子，看起來很邋遢，所以一開始我對他印象不佳。這老兄聽了之后也不怒，而是慢條斯理的辯解說，每個人都有自己喜歡的工作方式，我喜歡亂，你丫管我呢，要是不喜歡，我們可以在bench上畫條線劃清界線，從此井水不犯河水。那個學(xué)生聽了幾乎要吐血。lin教授。（錢澤南），還是做生化，研究轉(zhuǎn)錄因子。這位教授人很nice也很幽默，四位老師中我對他印象 最好。不過令人驚訝的是，watson此人相當(dāng)精神，走路象年輕人。我這一組其他三個人是:來自colorado可我還是高興不起來，因為還得解決1600刀(學(xué)費一共2600刀)。（二）同學(xué)和老師 　冷泉港的《蛋白質(zhì)純化與鑒定》培訓(xùn)班歷史相當(dāng)悠久，從1989年開始每年都開課，到今年是第十六次。Astra,Pura最后也摻雜著自己過去做蛋白質(zhì)純化的心得。我對這本書愛不釋手，于是就買了下來,這本書很奇怪，里面列出了很多具體實驗的步驟和解釋。原始的諺語是,Per呵呵。我下定決心上這門課，于是遞交了申請。老師一共有四個，每人負責(zé)一個模塊的實驗，持續(xù)三天時間,第三個是來自丹麥的Charlotte，是個博士生，做植物的。這老頭很有意思，帶這個培訓(xùn)班已經(jīng)帶了十二年了，到現(xiàn)在還是樂此不疲。的Albert我一開始不太理解，后來問他的學(xué)術(shù)經(jīng)歷，才明白是怎么回事。mini,還在網(wǎng)上itunes商店買過歌。anderson第一種呢，就是既然你恨他，那就殺了他好了。還有另一個笑話，suehwauniversity這個課結(jié)束之后，他還跑到冷泉港書店買了一堆蟲子毛絨玩具給兩個兒子做紀念品。Sigma系列因子能夠識別啟動子,body),我們的任務(wù)就是要用變性 劑溶解變性不溶的蛋白，然后做重折疊。body。HCl（鹽酸胍)來變性，作為對比。折疊中間產(chǎn)物容易相互接觸形成不溶的聚合物。HCl溶解的Sigma32。 　從這里開始，我要岔開一下，講一些跟這個模塊實驗沒太大關(guān)系，但是很有意思的東西。這種小柱子很簡單，把beads倒進去，沖洗一下就可以用來純化蛋白了，很方便。但我覺得對初做蛋白質(zhì)純化的人還是很有幫助的。column純化蛋白，由于beads如果用這種方法，A就不用在實驗室待一晚上了，因為一切都是自動完成的。比如，他得意說他是全美國最早用coomassie他告訴我們說，他幾十年了，總喜歡用這個buffer的配方，什么蛋白都喜歡這種buffer,EDTA glycerol　　 Tris實驗室里干，主要是純化細菌RNA混合了。Burgess設(shè)計了一個實驗讓我們做。來稀釋，稀釋了之后，變性的GFP就開始重折疊。glycerol,結(jié)果讓人很吃驚，Hamton賣的這個試劑盒，雖然配方都很fancy,但是一塌糊涂，沒有一種溶液能讓GFP重折疊的很好。這個實驗我還學(xué)到的一個教訓(xùn)是,不能迷信商業(yè)化的kit,Laboratory的，一生研究T7系統(tǒng)在大腸桿菌表達蛋白的應(yīng)用實在太廣泛了，但凡表達蛋白的兄弟姐妹們的不可能不知道這個系統(tǒng)。但是有一些溶原菌株,染色體里面已經(jīng)整合入了由LacUVRNA我曾經(jīng)想用細菌表達一個蛋白,而且估計這個蛋白會形成包涵體。broth有三種成分，其中一種是tryptone.Billstudier老爺子特別強調(diào)的是細菌的供氧。 最后，詳細內(nèi)容可以見下列文獻: 207234不但科學(xué)做得很好，而且還很愛國。painComplex)是一個很大的蛋白復(fù)合體，可以識別這些復(fù)制起始位點。實驗室一直想表達酵母的CDC6和ORC的重組蛋白，然后做結(jié)構(gòu)研究。他們估計是因為GST可以形成dimer，干擾CDC6的正常功能。這個CDC6一共花了他們18個月時間,　繞了這么大一圈，現(xiàn)在再回到第一個模塊的實驗來。HS值得一提的是絕大部分蛋白質(zhì)都是偏酸性，所以陰離子交換柱用的比陽離子交換柱頻繁得多。polymerase結(jié)合形 成復(fù)合體。PEI呢是一個帶正電的polymer，和酸性蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合以后聚合體沉淀出來。就是洗脫下來的蛋白里面還有PEI,如果現(xiàn)在就用透析的辦法降低鹽濃度，PEI和蛋白會重新形成沉淀。（九）硫酸氨沉淀的優(yōu)點是什么呢？最大的優(yōu)點是這東西雖 然能讓蛋白質(zhì)沉淀下來，但是不會讓蛋白質(zhì)變性，所以沉淀下來的蛋白質(zhì)一般可以 重新溶解。當(dāng)鹽濃度高到一定程度的時候，過多的鹽會跟蛋白質(zhì)疏水表面爭奪水分子，以至于蛋白質(zhì)疏水表面傾向于相互作用形成聚合物沉淀下來。這個公司用硫酸氨沉淀的方法來粗分蛋白。 Burgess強調(diào)說，用什么濃度把什么蛋白沉淀下來，完全是經(jīng)驗性的，而且每 次都不一定能重復(fù)的。離心去掉沉淀，保留上清，再向上清里面添加硫酸氨使?jié)舛葟?0%到30%,這個實驗的指導(dǎo)教授叫AlJun和Fos都是alpha 　怎么才能分離純化呢？首先要確定要純化什么因子，換句話說就是要決定純化跟什么特異DNA序列相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。凝膠過濾的產(chǎn)物再過DNA affinityHRaffinity其實在過柱子之前的核抽提物的準備 也是十分關(guān)鍵的。凍存在80度的hela泡在有 glycerol的buffer里面，第一件事情就是要用有鎂離子的PBS來沖洗幾遍。,另一個是當(dāng)然說是這么說，一些轉(zhuǎn)錄因子還是可能在勻漿的過程就漏出來。細胞核是最好分離的了，因為比其他的膜結(jié)構(gòu)重得多。 細胞核雖然被沉淀下來了，但里面還有很多染色質(zhì),如果DNA都降解漏出來，麻煩就大了。為了祛除hisone,實驗的下一步就是跑Sephacryl是色譜中及其重要的一個種類。filtration并不依賴 蛋白質(zhì)分子與柱材料的結(jié)合來分離蛋白。這個寬度非常要命，很多時候即使用了很好的柱子，蛋白頂峰也大致能分開,我沒仔細想，就告訴她用Gel柱子才跑得動。這兩個用途是其他種類的色譜沒法作到的。filtration的基本原理，現(xiàn)在談?wù)勎已b柱子的過程。 　　裝柱子本身就是一件很tricky的事情，以至與這課的教程上專門列了一小節(jié)來解釋怎么裝柱子。倒slurry的時候還得用玻棒引流，這樣可以盡可能的避免氣泡。加壓，讓resin繼續(xù)緊縮一下。volume)就會洗脫出來。如果裝的不均勻，葡聚糖j就會跑得形狀怪異。affinity這種方法誕生是六十年代的事情。filtration,固定在beads上面，然后用來純化蛋白呢？后來他試了一把，結(jié)果非常成功。Affinity比如我們實驗室研究的糖基轉(zhuǎn)移酶把，有兩個反應(yīng)底物，一個是nucleotidesugar,另一個是一個小蛋白質(zhì)amineDNA是雙鏈互補的結(jié)構(gòu)，堿基上的primary?。ㄊ澹〢P1的活性測定 剩下的就是一些活性測定。footprinting如果探針結(jié)合上蛋白了，速度會變慢很多，就會停滯在膠的上段；如果沒有結(jié)合上，探針就會自由的跑到膠的下段去。還有一個小竅門。EMSA也不例外。這種對照也很簡單，在蛋白質(zhì)與探針孵育的同時，加入沒有同位素標記的探針來競爭。GelDNase這個實驗步驟其實不復(fù)雜，但是有些tricky，實驗的關(guān)鍵是DNasealcohol)。聚乙烯醇的作用原理跟PEG很相似，第三個模塊的實驗里面會用到PEG沉淀。第一步是加Ca2+和Mg2+孵育一分鐘,丹麥女孩計時，然后我加樣品?！　⌒菹⒘艘徽欤砩先w學(xué)員和老師去一家sushi店飽餐了一頓生魚片。assay就可以測活了。 　　好了，現(xiàn)在聊一聊純化的實驗步驟。 　　細胞膜結(jié)構(gòu)的分離是一門大學(xué)問，著名的Methods 　　膜結(jié)構(gòu)分離的方法呢，有很多種，但是變來變?nèi)ィ瑹o非都是兩種基本方法的組合： 差速離心+蔗糖梯度離心。由于線粒體比其它膜結(jié)構(gòu)要重一些，所以線粒體沉淀下來，而其它膜結(jié)構(gòu)還在上清里面。測539。鈣離子能夠促進質(zhì)膜碎片的聚集，這樣在1500g這樣小的離心力下，質(zhì)膜也能被沉淀下來。蔗糖梯度離心是十分古老的一種方法，但直到現(xiàn)在還有很廣泛的應(yīng)用。我們吃罷午飯，就回來看離心管，果然看到一層棕色的東西浮在最上面。質(zhì)膜準備好了，下一步就得考慮怎么溶解質(zhì)膜。Sodium去垢劑其實是很大一門學(xué)問，我?guī)啄昵熬突ㄟ^好多力氣來學(xué)習(xí)其中的一些知識，但到現(xiàn)在為止還是只懂了一些皮毛。(2)兩性離子基團,X100和NP40大家都用得比較多。類似于TritonG250染料。尤其是Octyl單體分子量是628,膠束的單體聚集數(shù)是140,類似與Octylprotein?有時候用去垢劑并非完全是用來溶解膜蛋百，其實也可以用來去掉一些可溶蛋白雜質(zhì)。(6)是否需要用去垢劑來做Two我并不太喜歡這種方法，因為有一組人做了這個實驗，感覺分得并不是那么干凈，在可溶相還是有不少insulin問題是,很難預(yù)先就知道那種去垢劑會降低蛋白活性。dystrophy有關(guān)系，是一個研究熱點。Omannosyltransferase完全沒有活性，相比之下用了OctylGermglycan談到這里，我先向大家介紹一下NlinkedNXS/Tstructure往往是千奇百怪。/||type。typeethylene 然后呢，她就想把這個因子的受體給找出來。這樣樣品中蛋白的有效濃度實際變大了好多，容易出現(xiàn)聚集然后沉淀的現(xiàn)象。protocol把實驗完成了，是遠遠不夠的。assay。 這樣一來，純化出來的東西就是亂七八糟的了。實驗的問題，說到底，就是沒有好的測活方法。$$!!!有Ca2+結(jié)合的情況下，鈣調(diào)蛋白的構(gòu)象可以發(fā)生較大的改變，從而激活一系列酶的活性，比如cyclic這一個模塊的純化設(shè)計，可以說是最大限度的利用了鈣調(diào)蛋白的特殊性質(zhì)，我覺得設(shè)計的很精彩。重溶沉淀之后再做透析來脫鹽。因為對未知蛋白質(zhì)純化，首先就得有一個靠的住的測活方法,idoacetamide)是否敏感。另外，在設(shè)計測活方法之前，還必須搞清楚，有生物活性的物質(zhì)是不是蛋白質(zhì)。Sephadex教員的實驗助手只有一個人，而且非常不稱職，對實驗本身似乎不太了解，也不是很helpful，感覺比前幾個模塊的實驗助手差多了。phosphodiesterase,我知道要做這個試驗之后，幾乎要抓狂了。affinity我們測活之后，比較了各種去垢劑的純化效率，發(fā)現(xiàn)Triton有很多膜蛋白能與MDABF1相互作用， 但是只有一種膜蛋白能夠啟動下游的信號傳導(dǎo)， 促進Osteoblast的增長。assayreceptor可以被沉淀下來的原因。所以她就比照insulin)acid（唾液酸，一種帶負電的糖）和GlcNAc。最適合于純化這種蛋白的凝集素是ConA。\Man最前面的Asparagine多半被Nglycan修飾。Nlinked根據(jù)這個性質(zhì)，用固定有適當(dāng)?shù)哪氐腷eads，比如WGAagarose來部分純化insulin一直到前兩年，終于有一個實驗室證明了這個蛋白是有活性的。我舉一個例子。(7)去垢劑的用量是否足夠?要充分的溶解膜蛋白，去垢劑的用量必須足夠才行。partitioning？Tritoncholate是一種很弱的去垢劑，雖然不能用來很有效的溶解insulin比如ConA相比之下CHAPS單體分子量615,聚集數(shù)是10,遇到這種干擾問題，要么換去垢劑，要么換protein所以可以想見，這種染料不單能染蛋白質(zhì)，也能染一些去垢劑。而相比之下CHAPS和膽酸鈉之類的去垢劑就沒有這個問題。我想強調(diào)的一點是，聚乙氧乙醇基團與氧氣很容易發(fā)生反應(yīng)形成過氧化物,(3)糖類衍生物,比如Octyl首先，什么是去垢劑(detergent)呢？就是同時具有疏水和親水兩種基團的化合物。Chaps,選擇去垢劑很簡單，無非是想讓膜蛋白能被充分的溶解解離下來，同時又不使蛋白變性。到這里質(zhì)膜的分離就算完成了。勻漿里面加69%的蔗糖溶液，一直到終濃度變?yōu)?4%為止。cloth過濾，去掉了很多結(jié)締組織。nucleotidase　的活性)來分析分離方法的好壞，并加以改進。所有的膜結(jié)構(gòu)都會在此時沉淀下來，所以也包括質(zhì)膜。centrifugation）是粗分膜結(jié)構(gòu)的 一種常用方法。Enzymology有專門的一輯 整本都是講這個的。大家可能注意到，最后純化出來的受體只是粗產(chǎn)品。 　　SueHwa老師是SueHwa最后看結(jié)果的時候，我還特緊張，因為這是很重要的一份試驗數(shù)據(jù)，最后結(jié)果很不 錯，還受了老師表揚，呵呵。Isolution配好之后，就是加我們純化出來的組分，孵育十幾分鐘。I的用量和酶切時間?？梢噪S機的分解DNA，正常情況下，一段DNA探針各處被酶切的可能性大致相當(dāng)，如果跑膠再做放射自顯影的話，看到的會是DNAassay雖然能夠證明一段Oligos是否能和蛋白質(zhì)結(jié)合，卻還是不 能告訴我們該蛋白質(zhì)到底與哪一小段的序列直接接觸。interaction， 一兩個nucleotide不一樣就無法削弱的話， 說明看到的探針與蛋白質(zhì)的結(jié)合是跟探針序列緊密相關(guān)的。關(guān)鍵是陰性對照，來看蛋白質(zhì)與探針的結(jié)合是否特異。跑完如果把一塊玻璃板從膠上拿開的