【正文】 cerol。polymeraseRNA我來來回回一共轉(zhuǎn)化了五六次，最后終于找到了唯一的一個(gè)菌落。和Protein他主要研究真核生物的DNA復(fù)制。protein有GST的CDC6是可溶的，可是一旦把GST切掉了，CDC就沉淀出來了....%^amp。我們接著試了用sarkosyl做 變性劑的蛋白重折疊。 Sigma32在大腸桿菌過表達(dá)的時(shí)候，絕大部分都是inclusionpolymerase和DNA是結(jié)合的，所以PEI沉淀DNA的同時(shí)，把RNA但其實(shí)這種沉淀是蛋白質(zhì)純化中及其重要的一種方法。但是其實(shí)可以用一個(gè)低一點(diǎn)的濃度，只把serum把樣品分成五份，每份分別加硫酸氨至20%,AP1是一種很重要的sequence 　整個(gè)純化過程是這樣的：首先制備Hela細(xì)胞的核提取物，然后用硫酸氨沉淀的辦法粗分一下組分，小分子量蛋白(比如Histone高度40cm）。 　　核抽提物是怎么準(zhǔn)備的呢？首先，融解Hela細(xì)胞。KCl沒有什么好說的， 可以換成NaCl。比如lysosome把，比重和線粒體及過氧化酶體很相近。S300filtration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。filtration是很難把兩個(gè)蛋白完全分開的。 洗完了，就把resin重懸成50%的slurry，然后就是往柱子里頭倒了。 　　柱子裝好了，但還不能開始跑樣品。 　　忙活了半天，當(dāng)所有裝置都裝好的時(shí)候，感覺還是挺興奮的。他主要貢獻(xiàn)是通過研究ribonuclease呵呵。AP1的純化呢，則是利用了轉(zhuǎn)錄因子與DNA序列的特異結(jié)合。 蛋白質(zhì)的primaryaffinity 　　　Gel我們做膠的時(shí)候，指導(dǎo)老師要我們把一塊玻璃板的貼著膠的一面硅化（用sigmacote, 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中用了 第二種control,DNAase首先是做同位素標(biāo)記探針的stock之后呢就是做DNAse 好了，第二模塊的實(shí)驗(yàn)，到這里就差不多了。Lin是一個(gè)好老師，喜歡在做實(shí)驗(yàn)之前詳細(xì)給我們講解背景知識(shí)，這一 點(diǎn)上她比其他三位老師都做得好。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)主要有核膜，質(zhì)膜，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，溶酶體等等。需要強(qiáng)調(diào)的是，差速離心的分離是非常粗糙的，并不是十分干凈。然后就是用1500g離心了?！『蚈ctylglucoside,另外，有些去垢劑會(huì)嚴(yán)重的干擾一些proteinassay方法。receptor之類的膜蛋白,我們?cè)谠囼?yàn)中，先測(cè)了一下起始樣品的蛋白總濃度，然后以detergent之所以很多實(shí)驗(yàn)室之前都不成功，其中一個(gè)重要因素就是去垢劑。receptor。glycans 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常見的一種糖基修飾?！　　anMan代表Mannose甘露糖，而GlcNAc代表N乙酰葡萄糖胺.ConA主要識(shí)別alphamannose,（十九）MDABF1的啟示凝集素層析實(shí)際操作起來很簡(jiǎn)單，跟過簡(jiǎn)單的Ni柱子一樣。receptor的測(cè)活方法而設(shè)計(jì)了一個(gè)方法,MDABF1不僅僅給我以上的啟示。這種bindingchromatography和其他分析。教員叫Constantin，是一個(gè)俄羅斯人，在rutgers當(dāng)教授。一般有下列幾種方法。但我多少有一點(diǎn)本末倒置的感覺。這一個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)中，我們是從雞胗里面提取和純化鈣調(diào)蛋白，然后再做一些分析。Cholate則差好多。為什么呢?純化蛋白的過程中，各種膜蛋白都處于一種被去垢劑溶解的勻漿狀態(tài)，這種情況下，一些正常生理?xiàng)l件下不會(huì)與MDABF1結(jié)合的受體可能也會(huì)與其結(jié)合。所以呢，我感覺做實(shí)驗(yàn)，僅僅是follow這個(gè)因子對(duì)Osteoblast（成骨細(xì)胞）的增長有促進(jìn)作用。　保留在ER或者CisGolgi的膜蛋白,Nglycan往往是Highmannose這個(gè)Nglycan加上去之后，并不是就大功告成了，而是要經(jīng)歷一系列“裁減”，有的糖基會(huì)被去掉，新的糖基又會(huì)被加上，這樣最后的Nglycan純化膜蛋白用的最主要的兩種凝集素是WGA和ConA。我們用去垢劑溶解了膜蛋白之后，緊跟著的一步就是用Wheat是一種膜蛋白，跟muscularpartitioning。(5)是否需要用弱的去垢劑來去掉soluble　　　干擾比較嚴(yán)重，chaps,我強(qiáng)烈建議大家以后選擇和使用去垢劑的時(shí)候先考慮以下幾個(gè)問題：(1)選擇的去垢劑是否干擾蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定？cholate)X100,前面提到過，質(zhì)膜相比其他膜結(jié)構(gòu)而言是比較輕的，所以呢，在離心的過程中就會(huì)浮到上層來。勻漿用的緩沖液里面加有Ca2+，比較重要。拿上清再做第二次離心，這回離心力大了一個(gè)數(shù)量級(jí)，到了8000g。我覺得這種做法很不明智，因?yàn)橹亟M蛋白純化的實(shí)驗(yàn)實(shí)在不需要花幾千刀來冷泉港學(xué)的。胰島素受體即使溶解在去垢劑里面也能與胰島素接合，所以用簡(jiǎn)單的binding這樣三分鐘三個(gè)樣品都完成了。聚乙烯醇性質(zhì)就象一個(gè)分子海綿，占溶液體積不說，還跟蛋白質(zhì)搶奪水分子，所以加入這個(gè)東東之后呢，蛋白質(zhì)和探針的有效濃度都增大了，這樣有利于蛋白質(zhì)和探針的相互結(jié)合。這樣我們可以知道那一部分沒有被切到。另一種對(duì)照呢，是看蛋白質(zhì)與探針的結(jié)合是不是與探針序列有關(guān)，因?yàn)槿绻欠翘禺愋缘慕Y(jié)合，純化就沒有意義了。講，這個(gè)方法雖然很粗糙，但是比其他任何封底的辦法都管用。I蛋白質(zhì)或者核酸的伯胺基團(tuán)(primary需要?jiǎng)狱c(diǎn)腦筋的是一些利用特定蛋白質(zhì)特定性質(zhì)的親合層析。這個(gè)學(xué)生有一天突發(fā)奇想，既然inhibitor可以與enzyme結(jié)合，為什么不能把inhibitor純化效率比別的層析方法可以高出一兩個(gè)數(shù)量級(jí)。第三個(gè)呢，是柱子是否裝的均勻。pump)但是一個(gè)好處就是，樣品體積可以大一些。一個(gè)是脫鹽，另一個(gè)是確定蛋白大小。column里面并不與柱材料相互結(jié)合，所以很容易擴(kuò)散(diffusion)，擴(kuò)散的結(jié)果就是蛋白峰非常寬。filtrationH1，可以抑制體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 　　現(xiàn)在想起來，細(xì)胞器官的分離，幾乎無一例外都是利用細(xì)胞器比重不一樣來分離 的。KCl（十一）核抽提物 上回談到純化AP1轉(zhuǎn)錄因子的大致流程。S300這個(gè)模塊涉及的一些實(shí)驗(yàn)是最經(jīng)典的一些分離轉(zhuǎn)錄因子的方法，所以很有用。永遠(yuǎn)的轉(zhuǎn)錄因子 　　　 　第一個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后，我們進(jìn)入第二個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)。Dr.里 頭把抗體給純化出來。polymerase的各個(gè)亞基。這個(gè)東東我過去沒碰到，所以很感興趣。再加上sigma32 很奇怪，既有負(fù)電的表面，又有帶正電的表面，所以可以用陽離子交換柱。tag,這下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是還是沒有活性。Replication是冷泉港的現(xiàn)任主管，是一個(gè)絕對(duì)的牛人。這種flask的瓶底邊緣有幾處凹陷(類似于可樂塑料瓶底那樣的形狀)，能有效增加空氣培養(yǎng)基的混合。有意思的是，細(xì)菌有一種很有意思的特點(diǎn)，如果培養(yǎng)基里有足量的glucose，細(xì)菌會(huì)優(yōu)先攝取glucose,而不能攝取lactose。 這一點(diǎn)我深有體會(huì)。識(shí)別，而這個(gè)咚咚大腸桿菌是沒有的。Nationalreader，我們可以實(shí)時(shí)監(jiān)控折疊的效果。bufferpolymerase和glycerol 配方是這樣的: 這人特有意思，喜歡吹噓他發(fā)現(xiàn)的小trick。作完實(shí)驗(yàn)了之后，我好奇的問她，到底是什么試驗(yàn)花了這么長時(shí)間，結(jié)果她說她在用一個(gè)disposablecolumn的用法。我們先用試著重折疊GudnGudn32過表達(dá)在大腸桿菌里面的時(shí)候，絕大部分形成了不溶的包涵體(inclusion結(jié)果他常常講實(shí)驗(yàn)講到一半就得停下來接電話。guy!!!哈。MD但是他卻負(fù)責(zé)教一組純化轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)驗(yàn)。Burgess教授,　四月五號(hào)下午我趕到冷泉港，辦完登記手續(xù)后被告知晚上七點(diǎn)全體開會(huì)，與教員和同學(xué)見面。所以“從純化到星辰”實(shí)際的意思是，做好蛋白質(zhì)純化，以后就容易出人頭地。 我注意到有一本翻譯過來的書，書名叫做《蛋白質(zhì)純化與鑒定實(shí)驗(yàn)指南》。想到哪說到哪，文字挺松散的，見笑了。意思是through老板人很nice,但是他實(shí)在沒錢了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解決了，去年的退稅就這樣全搭進(jìn)去了,申請(qǐng)這個(gè)課前，我先跟他發(fā)過這老兄一看樂了，然后說你既然沒種殺人或者自殺，就剩第三種選擇了,后來發(fā)現(xiàn)此人相當(dāng)nice。shocksarkosyl的優(yōu)點(diǎn)是，雖然在高濃度下有變性作用，低濃度下卻對(duì)蛋白質(zhì)有穩(wěn)定的作用。就是放一大燒杯的緩沖液，里面有一個(gè)磁石可以不斷混合液體，然后一滴一滴加入變性的蛋白溶液。Burgess這一等不得了，從晚上七點(diǎn)等到了凌晨一點(diǎn)。（五）萬金油buffer 　glycerol50mM5%放冰上,hydrochloride（鹽酸胍）溶解變性，另一部分用sarkosylglycerol,這四種buffer。Studier的報(bào)告。promoter只能被T7RNABill2~3　這里再給大家講一個(gè)在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)的例子，一個(gè)很夸張的例子，但是很有啟發(fā)性。 CDC6是干什么的呢？這要從ORC說起。首先發(fā)現(xiàn)37度誘導(dǎo)表達(dá)出來的蛋白不溶，重折疊也沒有用。大家等著看把。HSPEI最后結(jié)果很不錯(cuò)，跑膠后用coomassie 丙酮沉淀，通過改變介電常數(shù)來降低蛋白質(zhì)的溶解度，從而沉淀，由于丙酮一類的 有機(jī)溶劑可以與蛋白質(zhì)的疏水表面相互作用，所以沉淀的同時(shí)，蛋白質(zhì)也會(huì)變性。他有一年去 一個(gè)公司做sabbatical。60%到70%，離心保留沉淀，然后分析沉淀里的蛋白,這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子看起來就象一雙筷子夾著DNA。 affinity勻漿器處理一 下,把細(xì)胞膜弄破。然后再來一個(gè)低速離心。再一離心，取上清就行了。filtration分辨率包括兩個(gè)因素，一個(gè)是兩個(gè)蛋白峰的距離，另一個(gè)是，蛋白峰的寬度。filtration,雖然gelHR這個(gè)過程最麻煩了，主要是不能引入氣泡，所以先得讓這個(gè)接頭裝置里面充滿緩沖夜，把氣泡趕出來。因?yàn)槊看窝b柱子，實(shí)際resin的總體積都會(huì)有微小的不同。column雖然很重要，但是這一步技術(shù)上來說要求很低。有人可能會(huì)問，然后用 Ni beads純化??？答案很簡(jiǎn)單，那個(gè)時(shí)候根本沒有molecular這些東東 大家應(yīng)該都熟，類似于Ni beads ,原理很簡(jiǎn)單，CNBr的碳對(duì)beads上的羥基發(fā)起親電進(jìn)攻，產(chǎn)生一種叫cyclic這是一個(gè)小竅門，但是給我們的一個(gè)啟示是，要做好affinity方法呢就只有兩種，一種是凝膠遷移率變動(dòng)分析(EMSA)，另一種是DNA水解酶Iinstructor先做一個(gè)gel做法很簡(jiǎn)單，就是蛋白質(zhì)和探針孵育的同時(shí)加入抗那種蛋白的抗體，抗體識(shí)別蛋白質(zhì)之后會(huì)形成更大的protein但是，如果有蛋白與特定區(qū)域相結(jié)合，DNaseassay第三步是加反應(yīng)中止液。四個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)之中，我最喜歡這個(gè)模塊。affinity首先用等滲緩沖夜來做組織的勻漿，然后就開始離心。這種方法對(duì)于分離 大鼠肝臟質(zhì)膜比較管用，對(duì)別的組織就不一定好用了。我們有一個(gè)折射儀，可以很快的測(cè)出溶液的折射率以及對(duì)應(yīng)的蔗糖濃度。所以，只能具體問題具體分析，一個(gè)一個(gè)去嘗試。去垢劑的疏水基團(tuán)一般是下面三種(1)直鏈或者支鏈烷基結(jié)構(gòu)(2)類固醇之類的多元環(huán)結(jié)構(gòu)(3)取代苯基結(jié)構(gòu)(比如大家常用的Triton所以一般商業(yè)化的,比較純的NP40和TritonX100和sodium(3)是否需要在以后的步驟里面用到離子交換層析或者疏水作用層析？離子型去垢劑會(huì)與相應(yīng)離子交換柱結(jié)合得很好，干擾蛋白質(zhì)的純化。type　Nglycan的蛋白質(zhì)，與mannose和glucose都能結(jié)合。這樣呢，就可以把膜蛋白和可溶蛋白分開。有一種酶叫Proteinagarose可以部分提純膜蛋白。膜蛋白的新生肽鏈在被翻譯合成的同時(shí)會(huì)被直接塞入ER|acids，所以特別適合于純化這種類型的蛋白，洗脫液可以用GlcNAc和Sialic說到PEG沉淀。而Dr.filtrationCHAPS,而我最后選擇去跑了一個(gè)2Dkinases,純化出來的組分再過疏水作用層析柱，就可以得到很純的Calmodulin了，用Commassiehydryl首先把雞胗剁碎勻漿，然后做粗分離，用硫酸銨沉淀的辦法把雜蛋白都沉淀下來。鈣調(diào)蛋白(Calmodulin)十分重要，幾乎在所有真核細(xì)胞里面都能找到。tag的蛋白amp。要想純化出一個(gè)未知蛋白，最最重要的是要有一個(gè)簡(jiǎn)單明了直接的測(cè)活方法。 她實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在正在做的是試圖用蛋白質(zhì)純化的辦法來找出MDABF1的受體。問題出在PEG沉淀這一步。具體的測(cè)活步驟非常簡(jiǎn)單，就是把I125標(biāo)記的胰島素和純化的組分混合然后孵育一段時(shí)間。type。上面。絕大部分膜蛋白的extracellular這個(gè)成功的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，如果用常規(guī)濃度下的Triton5:1的比例加去垢劑。prep,選用的去垢劑是否構(gòu)成干擾？凝集素是一種植物中提取的一系列可以與糖基結(jié)合的蛋白。比如大家常用的Tritonassay，用的是massieX100和NP40。Glucoside。下面就開始準(zhǔn)備蔗糖梯度離心(sucrose最好的辦法是利用細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)特征性的一些標(biāo)記物（比如plasma這兩種膜結(jié)構(gòu)也是很好分開的。professor。我學(xué)校離CSH很近，索性晚上就溜回去了，順便還把YL硬拉出來聽我匯報(bào)學(xué)習(xí)心得，呵呵。我們這一組里，我和丹麥女生負(fù)責(zé)做酶切，這個(gè)酶切可是把我們忙壞了。solution里面除了探針以外，還加了非特異DNA,類似于poly(dIdC) poly(dAdT)之類的東西。assay這樣打開膠夾層的時(shí)候,膠只會(huì)緊緊貼在一面玻璃上面，把膠和這整塊玻璃拿去放射自顯影就行了。原理很簡(jiǎn)單，把蛋白質(zhì)樣品和P32標(biāo)記的寡聚核苷酸探針 一起孵育十幾分鐘,6預(yù)裝柱子。DNA的primary 通用的親合層析包括IMAC(Immobilizedinteraction。整套裝置