【正文】 (2)生物活性不會因為透析而丟掉(3)Urea之類的變性劑是否降低生物活性(4)對化學(xué)修飾劑(比如sulfurblue都可以染出來?！　≌麄€純化步驟大概是這樣的。phosphatases純化胰島素受體的模塊結(jié)束之后，我們這一組人進(jìn)入到最后一個模塊，做鈣調(diào)蛋白的純化和分析。gel。比如一個實(shí)驗是從SF9里面純化一個hisOctyl需要強(qiáng)調(diào)的是，蛋白質(zhì)純化絕對不是萬能的。column來分開，每做一次assay都很麻煩。 其中她重點(diǎn)談到了MDABF1這個因子。Lin發(fā)現(xiàn)的MDABF1因子，分子量相對insulin大了好多，有50多KD，所以游離的因子也能被PEG沉淀下來。結(jié)果呢，這個測活試驗完全失敗了。是這樣的，她實(shí)驗室發(fā)現(xiàn)了一個蛋白質(zhì)因子胰島素受體不是酶，所以測活是利用胰島素與受體的特異結(jié)合。acid溶液。分泌出去的蛋白，或者已經(jīng)到細(xì)胞表面的膜蛋白的Nglycan往往是plexGlcNAclumen，同時就會被加上一整個樹枝狀的Nglycandomain注意，只能是部分提純，凝集素層析并不能一步登天，讓蛋白質(zhì)比活力一下子提高上千倍，至多幾十倍就已經(jīng)很不錯了?，F(xiàn)在常用來做蛋白質(zhì)純化的凝集素絕大部分是從植物中提取出來的。X100和NP40是很常用的去垢劑。Omannosyltransferaseprotein這種方法叫做，twomembrane如果此時用Octyl glucoside，就無法純化蛋白了，因為Octyl(4)如果在后續(xù)步驟中選用凝集素層析,所以如果要用到離子交換柱，要用非離子型或者兩性離子型的去垢劑。因為很多去垢劑會形成膠束結(jié)構(gòu)，分子量非常大，所以沒法用簡單的透析或者超濾來去掉。cholate對Bradford比如常用的BradfordX100都是小包裝，而且在包裝瓶子里面充有惰性氣體。比如TritonX100或者NP40)。我選的是Octyl我們這一組人選的四種去垢劑分別是:這個折射儀看起來很粗糙，但是卻十分好用。然后再把pellet轉(zhuǎn)移到Dounce勻漿器再弄均勻了。我們一組四個人，每人都分了一個新鮮冰凍的大鼠肝臟（解凍后很難聞），然后就是拿刀片剁啊剁。但不管是什么分離方法，本質(zhì)上都不完美，千萬不要指望從某篇文章找到一個方法就能套用。第一次是低速離心，只用600g，這么小的離心力下，只有未破的細(xì)胞和細(xì)胞核才會沉淀下來。其它的膜結(jié)構(gòu)中呢，線粒體是最重的，質(zhì)膜由于有膽固醇成分，所以是最輕的。chromatography來精制一下的。assistant主要是因為這是唯一一個設(shè)計膜蛋白純化的實(shí)驗，而膜蛋白純化是所有蛋白質(zhì)純化中最麻煩的一類。全體成員放假一天休息，而放假前一天晚上也沒有報告。我們是三個三個一做,酶切。的樣品都是通過跑柱子的fractions，轉(zhuǎn)錄因子必定是被稀釋得很厲害的。stockI無法酶切那一部分，我們看到的ladderfootprinting plex,在膠看起來就是探針的遷移率進(jìn)一步降低了。一下，使得這一面比較疏水，就不會與膠粘在一起了。plug，就是配少量gel溶液，然后加過量的TEMED，然后迅速加到玻璃板中間，這些膠還沒漏完就會凝固，所以會封住底端。assay足跡分析filtration，用的是Amersham賣的Superoseresin,如果要偶連的蛋白沒有l(wèi)ysine用這種偶連方法就不好。imido決定了ligand之后呢，就得考慮怎么把ligand偶連在beads上了。 proteinA 　　八卦完歷史，現(xiàn)在介紹一下親合層析的種類。cloning他實(shí)驗室那時侯有一個學(xué)生一個project是從葡萄球菌里面提取大量核酸酶，然后研究enzyme/inhibitor買來CNBR活化好的agarose，然后讓特定序列的寡聚核苷酸固定上去就行了，柱子也是最簡單便宜的一次性柱子。monitor加記錄儀。特定蛋白在柱子的洗脫體積與空體積的比值是一定的，所以只要知道了空體積，就能知道蛋白大概會在什么時候洗脫出來。所以呢，首先得測試這個柱子是否真的裝好了。我第一次做沒經(jīng)驗，費(fèi)了九牛二虎之力才搞定了。我過去裝柱子犯傻，不知道要這么做，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下面的resin的resin。filtration就柱子的材料而言，最主要的就是得把微珠做小一些，這樣空體積就會小一些，擴(kuò)散就不會那么嚴(yán)重。用別的方法解決了這個問題。有一次一個師妹遇到了一個難題，表達(dá)一個GSTtagged的蛋白 有一個降解產(chǎn)物。由于蛋白在gelfiltration當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品經(jīng)過這些微珠的時候，如果蛋白質(zhì)分 子體積太大，不能通過微珠的孔狀結(jié)構(gòu)，就會繞過微珠，很快的被洗脫下來。chromatography)， 我感覺還是很激動的。我們要的轉(zhuǎn)爐因子就在這里面。WR1339。細(xì)胞核是比較重的，所以一離心，馬上就沉淀下來了。就關(guān)鍵多了。低滲buffer里頭雖然鹽濃度很低，但也不是沒有鹽在里面。買來的。column，影響要轉(zhuǎn)錄因子的純化。volume）相差挺小，而AP1只有40~50KD已經(jīng)很小了。值得一提的是這個凝膠過濾層析。因為無法沉淀而被去掉。 　sequenceAP1其實(shí)不是一種均一的蛋白質(zhì)，實(shí)際上一種二聚體結(jié)構(gòu)，要么 是JunJun看看目標(biāo)蛋白到底在 哪里，就完事了。40%,albumin分開。這個公司是做單抗的，有一個工序是要從ascitesout）。 硫酸氨沉淀是怎么做的呢？其實(shí)很簡單，把磨細(xì)了的硫酸氨粉末往樣品溶液里 倒就行了，蛋白就會相繼沉淀下來。blue然后再用高鹽洗脫蛋白質(zhì)，而DNA和PEI結(jié)合很緊密，所以還是在沉淀里面。是什么呢？就是polyethyleneimine這些可溶的sigma50效果好了很多，至少沒有渾濁現(xiàn)象了。他猜到這個蛋白可能很不穩(wěn)定，對緩沖液要求可能很高，所以他讓一個本科生連續(xù)試了十多種buffer，最后發(fā)現(xiàn)如果用磷酸鉀＋谷氨酸鉀緩沖液，切掉GST之后CDC6就不會沉淀了。然后他們嘗試在室溫下誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)蛋白雖然可溶了，但是都被降解了。這個plex一旦形成，DNA真核生物的DNA有多個復(fù)制起始位點(diǎn) (replication在報告里面，他特別提到了表達(dá)純化CDC6蛋白的經(jīng)歷，我覺得十分有意思。 　　Bruceand翻十倍到20~30!要提高培養(yǎng)瓶的供氧，可以用baffled細(xì)菌首先攝取glucose，不攝取lactose,當(dāng)細(xì)菌長到一定密度，耗完glucose之后，就開始攝取lactose,從而開始誘導(dǎo)表達(dá)。studier研究發(fā)現(xiàn)即使很微量的lactose也能有效的誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。這個問題到了billpolymerase工作起來非常有效率，效率高到什么地步呢？就是表達(dá)一個蛋白，表達(dá)量可以占到大腸桿菌總蛋白量的50%!基因片斷。RNAsystem(pET本來這個報告是后來才聽到的，但是由于Burgess的模塊是唯一的涉及大腸桿菌鐘表達(dá)蛋白的，我把這一段提前來說說。HC變性還是用sarkosyl來變性，TGE+glycerol由于GFP折疊好了才能發(fā)熒光，用一個fluorescence我們試了所有這些buffer(N十二烷基肌氨酸鈉）溶解變性。也會對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有好處。過30分鐘，活性還會損失一半。很多蛋白，尤其是酶會十分穩(wěn)定。Tris和所以他就寫了一封信要了一些，結(jié)果效果奇好。Dr.只要在下端出口加一個長管子，她至少可以少等兩個小時。這個過程中，她好像沒什么事情，但是每隔20分鐘，她就會去一次coldpressure又是由實(shí)際柱高(即液體經(jīng)過的長度)來決定。假定我們對蛋白質(zhì)純化一無所知，所以講得很細(xì)致。HQ由于燒杯里的溶液蛋白量是逐漸增加的，所以一開始蛋白折疊中間產(chǎn)物能夠相互作用的幾率大大降低了。怎么做呢？方法有很多種，最簡單的是透析，把變性劑全部換掉。所以用sarkosyl做重折疊之前的變性劑是再好也不過的了。bodygenes的啟動子。Konstantin特搞，有一次他做報告，他的電腦的桌面上有一堆亂七八糟的文件夾，其中有一個竟然是divorce!我告訴坐我旁邊的一個老美，老美說也注意到了，認(rèn)為實(shí)在是很sad，呵呵。這老美連三八線都出來了。就是ignore一個笑話是這樣的,他那時侯不懂果蠅的遺傳學(xué)，完全靠自學(xué)和到處問人。詢問這個課的情況，而他也鼓勵我申請。連Burgess教授一次和我們吃飯的時候都承認(rèn)，watson有時候口無遮攔，讓他都覺得很難堪。的chad,做有絲分裂的。欲哭無淚啊。值得一提的是，冷泉港有相當(dāng)多的培訓(xùn)班和會議，是一個科學(xué)家交流和學(xué)習(xí)的中心。sufferingAstra 這是一個很模糊的想法，沒有想到的是，五年以后這個想法竟然實(shí)現(xiàn)了。從純化到星辰CSH蛋白質(zhì)純化課側(cè)記Royluo 引子 　 2000年5月6日，我一個人在合肥三孝口書店閑誑,希望買點(diǎn)參考書帶出國去。 幾個大字。torenown。這是冷泉港享有盛名的最主要原因。 來自Princeton的Adam,做海洋生物學(xué)的。現(xiàn)在開始八卦一下幾個老師，^_^ 總負(fù)責(zé)人是來自wisconsinmadison的Richard但是Burgess又承認(rèn)watson對他自己的學(xué)生很支持，很提拔，這幾年又盡心盡力為冷泉港籌 款，貢獻(xiàn)巨大。這老哥研究果蠅的,我知道后覺得特佩服，真正的科學(xué)家不應(yīng)該被自己過去所受的訓(xùn)練束縛死了，應(yīng)該是根據(jù)研究的需要隨時準(zhǔn)備學(xué)習(xí)新東西。第三位教員是來自Texas有一天有一個學(xué)生向這個老兄投訴說和實(shí)驗室另一人有矛盾。that 第四位教授是rutgers另外，他有兩個未成年的兒子，喜歡不斷打他手機(jī)。RNASigma相當(dāng)穩(wěn)定，不溶于triton,所以這一步，絕大部分垃圾就被去掉了。 　Burgess還要我們試了經(jīng)典的這個方法Burgess并不喜歡，因為，透析是個緩慢的過程。Burgess說的還真象那么回事，可事實(shí)上，嘿嘿。50陰離子交換柱，拿到的蛋白很少，回收率小于5%。比如他特別提到了disposable如果你嫌液體流得太慢（尤其是洗柱子的時候），可以在柱子下端出口連一個長的塑膠管子或者針管，這樣速 度會快很多。room?！?當(dāng)然最簡單的辦法還不是這個，最簡單的辦法的是把盛有洗液的容器放高，然后利用虹吸的原理讓液體源源不斷的流經(jīng)柱子。Burgess我們聽得都目瞪口呆。EDTA。pH這個穩(wěn)定的效果是十分驚人的。Burgess有一次不小心出了錯誤，把純化出來的RNA 　為了讓我們對這個然后把這些溶解的GFP溶液分到一個96孔板上,每個孔10微升，然后加入２０倍的refolding同時還試了TGE,plater的重折疊的效果都很好。Studier這老哥是Brookhaven系列質(zhì)粒)的發(fā)明者。polymerase如果在細(xì)菌培養(yǎng)基里面加入IPTG,大家可以想象，這種系統(tǒng)雖然很強(qiáng)大，但是表達(dá)量太大，對大腸桿菌有毒性，造成的結(jié)果就是大腸桿菌十分排斥表達(dá)蛋白的質(zhì)粒。studier做報告之后，才真相大白。原來如此?。?！ 所以要解決我原來的那個問題，用一種不含有乳糖的media做培養(yǎng)板就完事了。所以用這種培養(yǎng)基養(yǎng)菌，很省事，接種了第二天收細(xì)菌，提蛋白就行了。flask。purificationStillman這個蛋白,origin)，ORC(Origin復(fù)制的準(zhǔn)備工作就完成，只等其他kinase的激活，細(xì)胞從G1進(jìn)入S期，復(fù)制就開始。然后呢，他們就想到了加一個GSTStillman認(rèn)為谷氨酸根和磷酸根跟氯離子相比更接近與核酸,（八）”液體DEAE“ 接著我們用Poros而不是前面用的陰離 子交換柱呢？因為sarkosyl帶負(fù)電，會與陰離子交換柱結(jié)合得很好。32可以和細(xì)菌體內(nèi)的Core（聚乙烯亞胺）。這樣一來，好多垃圾蛋白和核酸都被去掉了。就可以清楚的看到RNA由于不同的蛋白，在不同的硫酸氨濃度下被分 別沉淀下來，這種方法把蛋白質(zhì)樣品粗粗的分離一下。蛋白質(zhì)在溶液里 面溶解度和鹽濃度有關(guān)系。fluidsSerum50%,（十）或者是JunFosspecific轉(zhuǎn)錄因子是極其重要的一類蛋白質(zhì)，真核生物的基因有5~10%是用來編碼這種蛋白的。到這里比活力會增加到原來的2倍。我們用的是Sephacryl這樣一來很多蛋白根本沒可能和AP1分開！這也就是為什么這一步純化倍數(shù)很小的原因。 這個純化步驟說明，不同的純化手段必須加以精心組合才會有最好的效果。據(jù)說這個公司有NIH的補(bǔ)貼， 所以價錢不貴。主要 有兩種成分，一個是10mM鎂離子可以穩(wěn)定細(xì)胞核,而其他細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞膜的成分比較輕一些，還留在上清里面。耗子根本不能分解吸收這種化合物，就積累在肝臟細(xì)胞的lysosome里面，使得lysosome比重變輕了一些，這樣就可以把lysosome從mitonchondria和peroxysome分出來了。按理說，到這一步就可以上柱子了，但是這種上清溶液里面還有不少histone（十二）GelGel如果 蛋白質(zhì)分子體積不是那么大，可以通過微珠的孔狀結(jié)構(gòu)，就會遲一些被洗脫下來。和其他色譜方法一個顯著的不同是：Gelfiltration她想要的蛋白50kD,而那個降解的產(chǎn)物有30KD。:)　 另外柱子里的微珠大小均勻一些也會有幫助。不能很精細(xì)的純化蛋白，但是它還有另兩個非常重要的用途。按道理說，要提高分辨率，柱子應(yīng)該是越長越細(xì)才好，這種柱子雖然不短，但是挺粗的。不均勻不說，還有一大堆氣泡。然后就是接上蠕動泵(peristaltic測試過程很簡單，就是跑一下藍(lán)色葡聚糖(blue第二個就是確定樣品會被稀釋多少。整套裝置不貴，功能卻很齊全。 　親合層析是目前最常用也最強(qiáng)大的一種蛋白質(zhì)純化技術(shù),interaction。這些技術(shù)，也沒Nibeads這些東西，Nibeads也是親合層析的一種，是好多年以后才發(fā)明的。