蛋白質(zhì)的分離純化概要-閱讀頁
2024-11-04 05:31本頁面
【正文】 。,第二十七頁，共六十一頁。n)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),第二十八頁，共六十一頁。i)較多。 別離蛋白質(zhì)的常用的親水性支持物。,離子交換纖維素 離子交換纖維素是以纖維素做支持介質(zhì)的。根據(jù)離子交換纖維素所含離子交換基團的性質(zhì)可分為強酸、強堿型和弱酸(ru242?，F(xiàn)將常用的離子交換纖維素列于下表中。,常用(ch225。nɡ)的離子交換纖維素,離子(l237。ngy242。,常用(ch225。nɡ)的離子交換纖維素,第三十一頁，共六十一頁。,在Sephadex上接上某種離子交換基團。因此，其別離能力比單純(dānch葡聚糖凝膠離子交換劑的交換量比相應的纖維素離子交換劑大，如DEAE—Sephadex的交換量大約是DEAE—纖維素的3.5～5.0倍。 zǐ jiāo hu224。,葡聚糖凝膠離子交換(l237。n)劑的性質(zhì),第三十四頁，共六十一頁。,將各種離子(l237。這類交換劑即堅硬、吸附容量大，形狀球形，能維持較好的流速及分辨率。 zǐ jiāo hu224。,〔三〕層析條件(ti225。n)的選擇,離子交換劑的選擇 選擇離子交換劑之前要了解樣品的性質(zhì)：熱穩(wěn)定性、帶電情況(q237。ng)、pH和鹽濃度對其活性和溶解度的影響。實驗室中最廣泛使用的是DEAE—和CM— 交換劑。①粗粒子：交換容量小、間隙大、分辨率底、流速較快。,第三十七頁，共六十一頁。因為離子(l237。所用緩沖液的種類、pH大小，決定 待別離組分的穩(wěn)定性和溶解度。 zǐ jiāo hu224。 zǐ jiāo hu224。使用陽離子交換(l237。n)劑時，要用陰離子型緩沖液〔磷酸、醋酸等〕；使用陰離子交換(l237。n)劑時要用陽離子型緩沖液〔Tris、胺鹽、吡啶等〕。,要得到好的別離效果，層析時要注意層析柱的高度和體積；上樣量的大?。幌疵撘后w積；洗脫速度；分級物的收集量。h233。離子交換層析所用的柱不用太長，以便縮短操作時間。 洗脫液體積和洗脫梯度的形狀：對柱的分辨率影響很大。pH和鹽濃度的改變又分為連續(xù)改變〔梯度洗脫〕和不連續(xù)改變〔階段洗脫〕 。sh249。,交換劑的處理就是將交換劑轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合別離目的的離子類型。改型就是用適當?shù)碾x子平衡，使交換劑帶上希望的離子。h242。,洗脫速度：太快或太慢都會降低柱的分辨率。一般(yībān)總洗脫體積在500—2000ml時，每管收集5—10ml,〔五〕離子交換劑的處理(chǔlǐ)和再生,離子交換劑價格較貴，用后再經(jīng)過再生處理，可反復屢次使用。,第四十頁，共六十一頁。ishēng)條件,第四十一頁，共六十一頁。 zǐ jiāo hu224。IgG可用QAE—Sephadex A—50或DEAE—Sephadex A—50別離。,〔六〕離子交換層系的應用(y236。ng)實例,第四十二頁，共六十一頁。它主要用于別離分子大小不同的生物大分子及測定(c232。ng)其分子量。,三、凝膠過濾(gu242。,凝膠層析載體是多孔凝膠。分子直徑比凝膠孔徑大的分子，不能進入凝膠顆粒的微孔(wēi kǒnɡ)里，只能經(jīng)過凝膠顆粒之間的孔隙。小分子向下移動的速度必然要落后于大分子。,(一) 根本原理,第四十四頁，共六十一頁。Kd由下式計算： Kd=(VeVo)/Vp 式中Ve為某種物質(zhì)從柱內(nèi)完全(w225。n)洗脫出來時洗脫液的體積；Vo為膠粒之間空隙的總?cè)莘e，也稱外水體積；Vp為膠粒內(nèi)部孔隙的總?cè)莘e，稱內(nèi)水體積。不同溶質(zhì)是按Kd由小到大的順序流出柱。,凝膠過濾法的分辨率是凝膠層析中的另一個重要(zh242。o)的特征性常數(shù)。 WW2分別為兩個物質(zhì)的洗脫峰的寬度，可以由通過峰邊拐點的兩條切線與基線交點間的距離來計算。)，ρ必須大于或等于1。,ρ=,2〔V2V1),W1+W2,第四十六頁，共六十一頁。,第四十八頁，共六十一頁。,第五十頁，共六十一頁。,第五十二頁，共六十一頁。,第五十四頁，共六十一頁。,第五十六頁，共六十一頁。,第五十八頁，共六十一頁。,第六十頁，共六十一頁。ir243。活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。其中前兩個階段為別離純化的前處理。常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。二乙基氨基乙基。h233。W1+W2,第六十一頁，共六十一
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