zhou目的蛋白質(zhì)表達、純化、檢測-閱讀頁
2025-05-22 12:14本頁面
【正文】 )會與蛋白質(zhì)上的非極性區(qū)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，成為一線狀長條分子，上面布滿 SDS 分子。 SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白質(zhì)分子間的天然的電荷差異。 kDa 實驗準備 ? 誘導(dǎo)、培養(yǎng) – 37℃ 恒溫搖床 ? 電泳檢測 – Hoefer miniVE Vertical Electrophoresis System 儀器與設(shè)備 ? LB培養(yǎng)基、 Amp、 IPTG ? 30%丙烯酰胺貯液 ? Tris()(濃縮膠 ), Tris()(分離膠 ) ? 10%SDS， 10%過硫酸銨（ APS作用主要是提供自由基，然后在促凝劑 TEMED的作用下使丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺聚合。 2）取 50ul過夜培養(yǎng)物接入 3ml含氨芐青霉素（ 50ug/ml）的 LB培養(yǎng)液， 37℃ 振蕩培養(yǎng) 2h以上，至對數(shù)中期（ A600=~）。 4）在剩余培養(yǎng)物中加入 IPTG至終濃度 1mmol/L， 37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3h，取 1ml樣品放于微量離心管中，室溫高速離心 1min ，沉淀懸浮于 100ul PBS中，加入溶菌酶（終濃度 1mg/ml） 37度消化。 5）消化后混合等體積的 1 x SDS凝膠加樣緩沖液， 100度加熱 3min，室溫高速離心 1min，冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。待膠凝固后（約需 30min倒掉 水，用吸水紙吸干 8） 配 5%濃縮膠將配好的濃縮膠立即倒入凝膠槽內(nèi)（以插入梳子不 溢出為宜），插入梳子 9） 待膠凝固后，拔出梳子，放入電泳槽中 10） 制備好的樣品加入上樣孔 11） 連接電泳儀 12） 打開電源，調(diào)整電壓至 80V，待樣品跑過濃縮膠（大約需 30min）后將電壓調(diào)至 120V，待指示劑（溴酚蘭）到達凝膠 的底部距離下緣 1cm時停止電泳，大約需 2h，電泳結(jié)束。 2. 過硫酸銨需新鮮配制，并注意濃度，否則影響膠凝固。 目的蛋白質(zhì)的檢測 考馬斯亮藍染色 ? 考馬斯亮藍 R250（ coomassie brilliant blue）是一種三苯甲烷紡織染料，又稱酸藍 83，分子上含有兩個 S03H基團，偏酸性，能結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團上。 ? 將凝膠浸泡在染色液中，室溫在搖床上緩慢染色 4小時（或過夜）。 ? 脫色后，將凝膠保存在水中或是 20%甘油的水中。 ? 闡述目的基因表達載體的構(gòu)建。 ? 包涵體的出現(xiàn)是目的基因的原核表達中常見問題，其發(fā)生原因是什么，如何解決？ End 實驗結(jié)果與分析
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1