【正文】 對(duì)beads上的羥基發(fā)起親電進(jìn)攻，產(chǎn)生一種叫cyclic 所以呢，在做親合層析之前，一定要根據(jù)蛋白質(zhì)本身的特點(diǎn)來(lái)選擇相應(yīng)的ligand。 由于這個(gè)酶與兩個(gè)底物都有結(jié)合， 所以可以把這兩種底物分別結(jié)合在beads上，然后跑兩次親合層析。比如我們實(shí)驗(yàn)室研究的糖基轉(zhuǎn)移酶把，有兩個(gè)反應(yīng)底物，一個(gè)是nucleotidesugar,另一個(gè)是一個(gè)小蛋白質(zhì)beads 之類(lèi)的東西， 幾乎所有人都會(huì)用到。這些東東 大家應(yīng)該都熟，類(lèi)似于Ni beads ,AffinityAffinity通用的親合層析包括IMAC(Immobilized從此以后，各種各樣的親合層析層出不窮，成為生物實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)純化的最主要工具。勉強(qiáng)答應(yīng)把自己名字署在在那個(gè)學(xué)生的文章，還強(qiáng)調(diào)如果沒(méi)有別人能重復(fù)，自己心就是懸著的。固定在beads上面，然后用來(lái)純化蛋白呢？后來(lái)他試了一把，結(jié)果非常成功。這些技術(shù)，也沒(méi)Nibeads這些東西，Nibeads也是親合層析的一種，是好多年以后才發(fā)明的。有人可能會(huì)問(wèn)，然后用 Ni beads純化??？答案很簡(jiǎn)單，那個(gè)時(shí)候根本沒(méi)有molecularhydrophobicfiltration,interaction。的變性和重折疊證明氨基酸序列就可以決定蛋白質(zhì)最后的三維結(jié)構(gòu)。Anfinsen是一個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)獲得者，可以說(shuō)是蛋白質(zhì)折疊研究的老祖宗。這種方法誕生是六十年代的事情。 　親合層析是目前最常用也最強(qiáng)大的一種蛋白質(zhì)純化技術(shù),column雖然很重要，但是這一步技術(shù)上來(lái)說(shuō)要求很低。DNAaffinity整套裝置不貴，功能卻很齊全。首先是蠕動(dòng)泵，然后是柱子，然后是UV所以我們?cè)谧龅臅r(shí)候，是從下端上樣的。如果裝的不均勻，葡聚糖j就會(huì)跑得形狀怪異。第二個(gè)就是確定樣品會(huì)被稀釋多少。因?yàn)槊看窝b柱子，實(shí)際resin的總體積都會(huì)有微小的不同。第一個(gè)就是確定voidvolume)就會(huì)洗脫出來(lái)。測(cè)試過(guò)程很簡(jiǎn)單，就是跑一下藍(lán)色葡聚糖(blue為什么呢？因?yàn)檫@種柱子的質(zhì)量必須很好才能起到分離蛋白的效果，否則是根本沒(méi)法work的。接觸不緊密的話，等于是沖淡了樣品，分辨率會(huì)降低。加壓，讓resin繼續(xù)緊縮一下。然后就是接上蠕動(dòng)泵(peristaltic這個(gè)過(guò)程最麻煩了，主要是不能引入氣泡，所以先得讓這個(gè)接頭裝置里面充滿緩沖夜，把氣泡趕出來(lái)。沉降３０分鐘后，就可以打開(kāi)柱子的下出液口，讓多余的緩沖液流出去。倒slurry的時(shí)候還得用玻棒引流，這樣可以盡可能的避免氣泡。不均勻不說(shuō)，還有一大堆氣泡。但是呢，有一個(gè)小竅門(mén)，就是必須先封閉柱子的下出口，往柱子里面倒10%體積的buffer。一開(kāi)始就是洗resin了，用粗制燒結(jié)玻板過(guò)濾的漏斗來(lái)洗，感覺(jué)這方法還挺快的。 　　裝柱子本身就是一件很tricky的事情，以至與這課的教程上專(zhuān)門(mén)列了一小節(jié)來(lái)解釋怎么裝柱子。按道理說(shuō)，要提高分辨率，柱子應(yīng)該是越長(zhǎng)越細(xì)才好，這種柱子雖然不短，但是挺粗的。HRXK26/40的空柱子，然后往里面填充Sephacrylfiltration的基本原理，現(xiàn)在談?wù)勎已b柱子的過(guò)程。（十三）裝柱子的學(xué)問(wèn)。這兩個(gè)用途是其他種類(lèi)的色譜沒(méi)法作到的。不能很精細(xì)的純化蛋白，但是它還有另兩個(gè)非常重要的用途。雖然gel 　　嘮叨了一大堆，我想表達(dá)的一個(gè)中心意思就是：如果你想從一個(gè)蛋白質(zhì)混合物很干 凈的把一個(gè)蛋白純化出來(lái)，Gel柱子才跑得動(dòng)。另外柱子里的微珠大小均勻一些也會(huì)有幫助。如果要想蛋白峰寬度變窄一點(diǎn)，怎么辦呢？就樣品而言，體積越小越好，理想狀況是小于柱體積的２％。:)　 filtration,現(xiàn)在想起來(lái)，這實(shí)在是個(gè)昏招。我沒(méi)仔細(xì)想，就告訴她用Gel她想要的蛋白50kD,而那個(gè)降解的產(chǎn)物有30KD。 說(shuō)一件我的糗事。另外，兩個(gè)不同大小蛋白的洗脫體積的差別與分子量差別的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，所以可以想見(jiàn)，如果分子量相近（比如只差兩三倍）的話，洗脫位置也會(huì)相近，Gel這個(gè)寬度非常要命，很多時(shí)候即使用了很好的柱子，蛋白頂峰也大致能分開(kāi),filtration分辨率包括兩個(gè)因素，一個(gè)是兩個(gè)蛋白峰的距離，另一個(gè)是，蛋白峰的寬度。但是這個(gè)特點(diǎn)也給Gel并不依賴(lài) 蛋白質(zhì)分子與柱材料的結(jié)合來(lái)分離蛋白。和其他色譜方法一個(gè)顯著的不同是：GelGel filtration如果 蛋白質(zhì)分子體積不是那么大，可以通過(guò)微珠的孔狀結(jié)構(gòu)，就會(huì)遲一些被洗脫下來(lái)。這些微珠呢，并不是 實(shí)心的，而是有很多孔狀結(jié)構(gòu)。Gel是色譜中及其重要的一個(gè)種類(lèi)。Gelfiltrationcolumn。實(shí)驗(yàn)的下一步就是跑Sephacryl（十二）Gel的柱子了。沉淀重懸一下就可以跑Sephacryl為了祛除hisone,按理說(shuō)，到這一步就可以上柱子了，但是這種上清溶液里面還有不少histone再一離心，取上清就行了。KCl)來(lái)破碎細(xì)胞核。 細(xì)胞核雖然被沉淀下來(lái)了，但里面還有很多染色質(zhì),如果DNA都降解漏出來(lái)，麻煩就大了。耗子根本不能分解吸收這種化合物，就積累在肝臟細(xì)胞的lysosome里面，使得lysosome比重變輕了一些，這樣就可以把lysosome從mitonchondria和peroxysome分出來(lái)了。一種辦法就是往一堆無(wú)辜的耗子注射一種特殊的去垢劑叫Triton有些時(shí)候，可以用一些古怪的辦法來(lái)分離。細(xì)胞核是最好分離的了，因?yàn)楸绕渌哪そY(jié)構(gòu)重得多。而其他細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞膜的成分比較輕一些，還留在上清里面。然后再來(lái)一個(gè)低速離心。,當(dāng)然說(shuō)是這么說(shuō)，一些轉(zhuǎn)錄因子還是可能在勻漿的過(guò)程就漏出來(lái)。鎂離子可以穩(wěn)定細(xì)胞核,MgCl2MgCl2。,另一個(gè)是主要 有兩種成分，一個(gè)是10mM勻漿器處理一 下,把細(xì)胞膜弄破。這種低滲buffer鹽濃度很低，所以由于滲透壓的影響， hela細(xì)胞膜會(huì)變得比較脆弱。凍存在80度的hela泡在有 glycerol的buffer里面，第一件事情就是要用有鎂離子的PBS來(lái)沖洗幾遍。據(jù)說(shuō)這個(gè)公司有NIH的補(bǔ)貼， 所以?xún)r(jià)錢(qián)不貴。我們?cè)谶@個(gè)模塊用的細(xì)胞都不 是自己長(zhǎng)的，而是直接從一個(gè)公司Biovest因?yàn)榧?xì)胞器官的分離的 方法已經(jīng)很成熟了。其實(shí)在過(guò)柱子之前的核抽提物的準(zhǔn)備 也是十分關(guān)鍵的。 這個(gè)純化步驟說(shuō)明，不同的純化手段必須加以精心組合才會(huì)有最好的效果。affinitycolumn上的DNAaffinity這樣一來(lái)很多蛋白根本沒(méi)可能和AP1分開(kāi)！這也就是為什么這一步純化倍數(shù)很小的原因。裝好的柱子分辨率真的是很低，AP1的洗脫體積跟空體積(void大概由于不是那么精細(xì)，所以可以自己手工裝柱，我們用的柱子是Amersham的XK26/40(,HR我們用的是Sephacryl 比活力從510倍一下子提到了50~100倍。凝膠過(guò)濾的產(chǎn)物再過(guò)DNA affinity到這里比活力會(huì)增加到原來(lái)的2倍。H1)另外就是，可以把這種特異序列的DNA固定在柱子上，然后做親合層析，純化效率會(huì)非常高。 　怎么才能分離純化呢？首先要確定要純化什么因子，換句話說(shuō)就是要決定純化跟什么特異DNA序列相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。specific轉(zhuǎn)錄因子是極其重要的一類(lèi)蛋白質(zhì)，真核生物的基因有5~10%是用來(lái)編碼這種蛋白的。這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子看起來(lái)就象一雙筷子夾著DNA。Helix的一邊有很多Leu,和另一個(gè)helix形成LeucineJun和Fos都是alpha或者是JunFosspecific轉(zhuǎn)錄因子，在很多生理過(guò)程里都有作用。這個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)主要是要從Hela細(xì)胞里純化AP1。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)教授叫Al（十）60%到70%，離心保留沉淀，然后分析沉淀里的蛋白,40%到50%,離心去掉沉淀，保留上清，再向上清里面添加硫酸氨使?jié)舛葟?0%到30%,50%,30%,有一個(gè)很簡(jiǎn)單的方法可以用來(lái)估計(jì)蛋白質(zhì)沉淀所需硫酸氨的濃度。Burgess強(qiáng)調(diào)說(shuō)，用什么濃度把什么蛋白沉淀下來(lái)，完全是經(jīng)驗(yàn)性的，而且每 次都不一定能重復(fù)的。 Serumalbumin沉淀下來(lái)，從而把抗體和serumalbumin一起沉淀了。這個(gè)公司用硫酸氨沉淀的方法來(lái)粗分蛋白。fluids他有一年去 一個(gè)公司做sabbatical。Dr.當(dāng)鹽濃度高到一定程度的時(shí)候，過(guò)多的鹽會(huì)跟蛋白質(zhì)疏水表面爭(zhēng)奪水分子，以至于蛋白質(zhì)疏水表面傾向于相互作用形成聚合物沉淀下來(lái)。蛋白質(zhì)在溶液里 面溶解度和鹽濃度有關(guān)系。硫酸氨沉淀的機(jī)理是什么呢？簡(jiǎn)而言之就是鹽析（salt 丙酮沉淀，通過(guò)改變介電常數(shù)來(lái)降低蛋白質(zhì)的溶解度，從而沉淀，由于丙酮一類(lèi)的 有機(jī)溶劑可以與蛋白質(zhì)的疏水表面相互作用，所以沉淀的同時(shí)，蛋白質(zhì)也會(huì)變性。我舉兩個(gè)例子把：TCA沉淀大家都熟悉的。硫酸氨沉淀的優(yōu)點(diǎn)是什么呢？最大的優(yōu)點(diǎn)是這東西雖 然能讓蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，但是不會(huì)讓蛋白質(zhì)變性，所以沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)一般可以 重新溶解。由于不同的蛋白，在不同的硫酸氨濃度下被分 別沉淀下來(lái)，這種方法把蛋白質(zhì)樣品粗粗的分離一下。說(shuō)實(shí)話我過(guò)去也很少接觸，但是在這個(gè)課里面，四組實(shí)驗(yàn)中有 三個(gè)都用到了這個(gè)方法，可見(jiàn)其重要性。不常做生化的同學(xué)可能對(duì)硫酸氨沉淀的方法不熟悉。（九）就可以清楚的看到RNA最后結(jié)果很不錯(cuò)，跑膠后用coomassie用低鹽buffer重溶沉淀的蛋白,過(guò)免疫親合柱就行了。就是洗脫下來(lái)的蛋白里面還有PEI,如果現(xiàn)在就用透析的辦法降低鹽濃度，PEI和蛋白會(huì)重新形成沉淀。這樣一來(lái)，好多垃圾蛋白和核酸都被去掉了。polymerase+sigma32都沉淀了下來(lái)。RNAPEI呢是一個(gè)帶正電的polymer，和酸性蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合以后聚合體沉淀出來(lái)。（聚乙烯亞胺）。PEI核心辦法是用免疫親合柱來(lái)純化。polymerase結(jié)合形 成復(fù)合體。32可以和細(xì)菌體內(nèi)的Corebody,但是也有一部分 是可溶的。Burgess要我們作的另一個(gè)很重要的實(shí)驗(yàn)。值得一提的是絕大部分蛋白質(zhì)都是偏酸性，所以陰離子交換柱用的比陽(yáng)離子交換柱頻繁得多。而不是前面用的陰離 子交換柱呢？因?yàn)閟arkosyl帶負(fù)電，會(huì)與陰離子交換柱結(jié)合得很好。HS分離了出來(lái)。HS接著我們用Poros步驟和前一個(gè)類(lèi)似，只是這一次是突然稀釋至25倍體積。HCl溶解sigma32之后的重折疊，結(jié)果很糟糕?！±@了這么大一圈，現(xiàn)在再回到第一個(gè)模塊的實(shí)驗(yàn)來(lái)。（八）”液體DEAE“ 大家等著看把。 這以后，他們表達(dá)的CDC6都有活性了，后來(lái)做了一系列的電鏡三維結(jié)構(gòu)重構(gòu)實(shí)驗(yàn)，研究CDC6和ORC的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。這個(gè)CDC6一共花了他們18個(gè)月時(shí)間,Stillman認(rèn)為谷氨酸根和磷酸根跟氯離子相比更接近與核酸,%$^!!! 幾乎是山窮水盡了，但是做這個(gè)project的博士后還是沒(méi)有放棄希望，他做了最后的孤注一擲。正當(dāng)他們滿心歡喜的以為問(wèn)題解決了的時(shí)候，意外又出現(xiàn)了。他們估計(jì)是因?yàn)镚ST可以形成dimer，干擾CDC6的正常功能。然后呢，他們就想到了加一個(gè)GST首先發(fā)現(xiàn)37度誘導(dǎo)表達(dá)出來(lái)的蛋白不溶，重折疊也沒(méi)有用。首先他們嘗試真核系統(tǒng)來(lái)表達(dá)，但是意外的是，他們發(fā)現(xiàn)表達(dá)出來(lái)的CDC6完全沒(méi)有活性。實(shí)驗(yàn)室一直想表達(dá)酵母的CDC6和ORC的重組蛋白，然后做結(jié)構(gòu)研究。復(fù)制的準(zhǔn)備工作就完成，只等其他kinase的激活，細(xì)胞從G1進(jìn)入S期，復(fù)制就開(kāi)始。plex。在G1期里面，CDC6這個(gè)蛋白會(huì)與ORC結(jié)合，同時(shí)讓MCM(DNA解旋酶)也裝載到ORC上,形成一個(gè)prereplicationComplex)是一個(gè)很大的蛋白復(fù)合體，可以識(shí)別這些復(fù)制起始位點(diǎn)。origin)，ORC(Origin CDC6是干什么的呢？這要從ORC說(shuō)起。thepain這個(gè)蛋白,這是一個(gè)到現(xiàn)在為止都沒(méi)有完全弄明白的領(lǐng)域。我們的晚間報(bào)告有一個(gè)是他作的。不但科學(xué)做得很好，而且還很愛(ài)國(guó)。Stillman　這里再給大家講一個(gè)在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)的例子，一個(gè)很夸張的例子，但是很有啟發(fā)性。（七）古怪的CDC6 207234purificationExpression 最后，詳細(xì)內(nèi)容可以見(jiàn)下列文獻(xiàn): flask。2~3如果有足夠氧氣在培養(yǎng)基里面,studier老爺子特別強(qiáng)調(diào)的是細(xì)菌的供氧。所以用這種培養(yǎng)基養(yǎng)菌，很省事，接種了第二天收細(xì)菌，提蛋白就行了。lactose。這種培養(yǎng)基含有成比例的glucoseBill原來(lái)如此?。?！ 所以要解決我原來(lái)的那個(gè)問(wèn)題，用一種不含有乳糖的media做培養(yǎng)板就完事了。Bill由于milkbroth有三種成分，其中一種是tryptone.studier做報(bào)告之后，才真相大白。雖然當(dāng)時(shí)我懷疑過(guò)本底表達(dá)是罪魁禍?zhǔn)祝俏覜](méi)有仔細(xì)想過(guò)本底是怎么 來(lái)的。我當(dāng)時(shí)就懷疑是因?yàn)楸磉_(dá)的蛋白對(duì)大腸桿菌有毒性，僅僅是本底的一點(diǎn)表達(dá)就足以殺死細(xì)菌。我曾經(jīng)想用細(xì)菌表達(dá)一個(gè)蛋白,而且估計(jì)這個(gè)蛋白會(huì)形成包涵體。大家可以想象，這種系統(tǒng)雖然很強(qiáng)大，但是表達(dá)量太大，對(duì)大腸桿菌有毒性，造成的結(jié)果就是大腸桿菌十分排斥表達(dá)蛋白的質(zhì)粒。RNA的表達(dá)，就可以啟動(dòng)目的蛋白的表達(dá)。RNA如果在細(xì)菌培養(yǎng)基里面加入IPTG,polymeraseoperon控制的T7但是有一些溶原菌株,染色體里面已經(jīng)整合入了由LacUVpolymerasepromoter只能被T7promoter來(lái)控制基因的表達(dá)。系統(tǒng)在大腸桿菌表達(dá)蛋白的應(yīng)用實(shí)在太廣泛了，但凡表達(dá)蛋白的兄弟姐妹們的不可能不知道這個(gè)系統(tǒng)。系列質(zhì)粒)的發(fā)明者。inductionRNALaboratory的，一生研究T7Studier這老哥是BrookhavenStudier的報(bào)告。（六）興風(fēng)作浪的乳糖(lactose) 這個(gè)實(shí)驗(yàn)我還學(xué)到的一個(gè)教訓(xùn)是,不能迷信商業(yè)化的kit,的重折疊的效果都很好。 另外，不論是用Gudn最強(qiáng)的是TGE+35%結(jié)果讓人很吃驚，Hamton賣(mài)的這個(gè)試劑盒，雖然配方都很fancy,但是一塌糊涂，沒(méi)有一種溶液能讓GFP重折疊的很好。platerglycerol,這四種buffer。gl