蛋白質(zhì)的分離純化概要-文庫(kù)吧資料
2024-11-04 05:31本頁(yè)面
【正文】 、瓊脂糖凝膠(sepharose)和合成凝膠(Trisacryl和Fractogel)。早期用于別離氨基酸、小肽和其它小分子物質(zhì)的離子交換樹(shù)脂的支持物是聚苯乙烯類(lèi)。,可用來(lái)作為交換劑支持物的物質(zhì)種類(lèi)(zhǒngl232。,離子交換基團(tuán)(jī tu225。因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)在pH6—8之間穩(wěn)定，所以常用弱酸或弱堿型交換劑。 強(qiáng)酸和強(qiáng)堿型交換劑能在較廣泛的pH范圍內(nèi)〔pH2—12〕完全解離。假設(shè)按酸堿性的強(qiáng)弱，又可分為強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、弱酸(ru242。,第二十六頁(yè)，共六十一頁(yè)。所以用一定濃度的鹽溶液或一定pH 的緩沖液就可把蛋白質(zhì)從離子交換劑上洗脫下來(lái)。,帶電蛋白質(zhì)分子(fēnzǐ)與交換劑的結(jié)合是可逆的。 zǐ jiāo hu224。當(dāng)pH〉pI，分子帶負(fù)電，可結(jié)合陰離子交換劑；當(dāng)pHpI，分子帶正電，可結(jié)合陽(yáng)離子交換劑。 陰離子交換劑: 解離基團(tuán)帶正電, 結(jié)合陰離。 離子交換劑是通過(guò)化學(xué)反響將解離基團(tuán)引入到惰性支持物上形成的。 zǐ jiāo hu224。,第二十四頁(yè)，共六十一頁(yè)。樣品集中在中間。ngh233。,一、層析的一般(yībān)原理,如果柱頂參加32mg樣品，樣品的質(zhì)量分配系數(shù)D為1，即樣品在兩相中是等量分配。,分配系數(shù): k=Cs/Cm ,物質(zhì)在固定相與(xiāngyǔ)流動(dòng)相濃度之比。,第二十二頁(yè)，共六十一頁(yè)。 根據(jù)兩相的狀態(tài)，層析法可分為：氣相層析和液相層析；按層析原理可分為：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和親和層析等。)流動(dòng)相。特征：有一個(gè)(yī ɡ232。,第二十一頁(yè)，共六十一頁(yè)。同樣純的蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中，應(yīng)以單一的沉降速度移動(dòng)。ng)分析法、免疫化學(xué)法、N末端氨基酸分析法等。 蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定通常采用的方法有：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉降(ch233。nd249。 總活力=活力單位/ml酶液總體積〔ml〕 比活力=總活力單位數(shù)/總蛋白〔氮〕mg 純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力 回收率〔產(chǎn)率〕=〔每次總活力/第一次總活力〕100%,第二十頁(yè)，共六十一頁(yè)。zh242。zh242。l236。,第十九頁(yè)，共六十一頁(yè)。 常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。進(jìn)一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。,細(xì)分級(jí)別離,一般蛋白質(zhì)樣品(y224。o)的有機(jī)溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機(jī)溶劑別離不同的蛋白質(zhì)。假設(shè)預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將其逐漸參加蛋白質(zhì)溶液中，防止有機(jī)溶劑局部濃度過(guò)高，那么在很大程度上解決變性問(wèn)題。,第十七頁(yè)，共六十一頁(yè)。 有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個(gè)： 降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子外表可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。,〔3〕有機(jī)溶劑法,與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低(ji224。 不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，因此通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH到目的蛋白的等電點(diǎn)，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開(kāi)(fēn kāi)，從而除去大量雜蛋白。n),蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液pH變化而變化。,〔2〕等電點(diǎn)沉淀(ch233。nb225。如：,血清(xu232。,不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子外表(biǎomi224。同時(shí)鹽離子可以中和蛋白質(zhì)的外表電荷，也促進(jìn)蛋白的沉淀。)中參加大量的中性鹽[〔NH4)2SO4，Na2SO4]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析。n xī),向蛋白質(zhì)溶液(r243。,粗分級(jí)別離,第十三頁(yè)，共六十一頁(yè)。xīn)、凝膠過(guò)濾 溶解度 等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀 電荷 電泳、離子交換層析 吸附性質(zhì) 吸附層析〔羥基磷灰石層析、疏水作用層析〕 對(duì)配體分子 親和層析 的生物親和力,第十二頁(yè)，共六十一頁(yè)。)純化,蛋白質(zhì)別離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來(lái)的。,第十一頁(yè)，共六十一頁(yè)。 ch,第三節(jié) 蛋白質(zhì)別離(fēnl237。 對(duì)于一些(yīxiē)和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽、稀堿、稀酸，常在提取液中參加適量的有機(jī)溶劑，
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