【正文】 的等電點位置上 ，也就是說被聚焦于一個狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點聚焦也稱為聚焦電泳。 等電聚焦電泳（ isoelectric focusing electrophoresis, IEFE） 利用具有 pH梯度 的支持介質(zhì)分離 等點電不同 的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。 ? 蛋白質(zhì) b： 由相對分子質(zhì)量為 25000的單一亞基組成的四聚體，該蛋白質(zhì)的等電點也是 pI=。 作業(yè)： 1997年清華大學(xué)考研題 ? 有兩個純的蛋白質(zhì) a和 b，相對分子質(zhì)量都是100000的近似球形的蛋白質(zhì)。該法主要利用了 蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì) 。 SDS （十二烷基磺酸鈉） ? SDS（十二烷基磺酸鈉） 是一種 陰離子型表面活性劑 ，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約 1 ? 。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù) , 稱為電泳 (electrophoresis) 。 ? 對 蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂 等尤為有利。 凝膠色譜： （分子排阻色譜法 ） 凝膠色譜分離機理 HPLC的 特點 ? 具有氣相層析的全部優(yōu)點。 ? 小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。 離子交換色譜法分離機理 ? 以凝膠 (gel) 為固定相。 ?應(yīng)用 離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。 飽和烴 烯 芳烴 醚 醛酮 酸 液固吸附色譜分離機理 分離過程是一個吸附 —— 脫附的平衡過程。 各組分的出峰順序 極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。它是在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進了氣相層析的理論，利用 高壓輸送流動相，擁有高效固定相及高靈敏度檢測器， 具有氣相層析的全部優(yōu)點。 高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC) ? 也稱 高壓液相層析 （ high pressure liquid chromatography）。 液相色譜 (liquid chromatograph, LC) ? LC同樣可分為 液固色譜法 (LSC)和 液液色譜法(LLC)。某些快速分析中，一秒鐘可以分析若干份。因此可用于痕量分析。主要通過選用高選擇性的固定液。例如，用毛細管，可以分析輕油中 150個組份。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。 ? 當 汽化后的樣品 被 載氣 帶入色譜柱中運行時，組分就在其中的兩相間進行 反復(fù)多次的分配（吸附－脫附－放出） 由于固定相對各種組分的 吸附能力 不同，各組份在色譜柱中的 運行速度 就不同，經(jīng)過一定的柱長后，便彼此分離，按順序離開色譜柱進入檢測器，產(chǎn)生的離子流信號經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰。但本法必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此 親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制 。 含配體溶液 收集目的蛋白 洗下未結(jié)合的蛋白 混合蛋白樣品 平衡液 帶有配體的樹脂珠（或膠粒） 優(yōu) 點 ? 親和層析純化 過程簡單 、 迅速 ，且 分離效率高 。 所以有時只用親和層析就可使蛋白質(zhì)的純化提高 1000至10000倍 。 親和層析 (Affinity chromatography) 當?shù)鞍踪|(zhì)混合物通過裝有連接了配體的基質(zhì)的親和層析柱時 ， 只有 靶蛋白可以特異地與基質(zhì)結(jié)合 ， 而其它 沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來 。 配體通常指的是能與另一個分子或原子結(jié)合 （ 一般是非共價結(jié)合 ） 的分子 、 基團 、 離子 、 或原子 。 帶有 SO3－ 或 COO－ 基團 ， 通常以 SO3－ Na＋ 或COO－ H＋ 形式出現(xiàn)的叫做 陽離子交換基 ； 帶有 N＋ (C2H5)基團通常以 N＋ (C2H5) Cl－ 出現(xiàn)的叫做 陰離子交換基 。 ? 肌紅蛋白（馬心?。? 16900 ? 過氧化氫酶（馬肝） 247500 ? 細胞色素 c（牛心肌） 13370 ? 肌球蛋白（鱈魚?。? 524800 ? 糜蛋白酶原（牛胰） 23240 ? 血清清蛋白（人） 68500 如果被分離的蛋白質(zhì)樣品中各個成分受溶液 pH的影響 ， 或帶 正電荷或帶負電荷 ， 因此可利用離子交換層析法進行分離 。 例如 Sephadex G50的排阻極限為 30,000，它表示分子量大于 30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。 所有大于排阻極限的分子都不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出， 所以它們同時被最先洗脫出來。 聚丙烯酰胺凝膠 選擇何種凝膠以及它的型號 ， 這需要 根據(jù)實驗條件 ， 溶質(zhì)的分子量大小和分離工作的目的而定 ， 每種型號凝膠都有一定分離溶質(zhì)分子量的范圍 ， 選擇的型號凝膠要能 滿足實驗要求 。 瓊脂糖凝膠不帶電荷 ， 不受微生物作用而降解 ， 但對熱不穩(wěn)定 ， 易受 pH影響 (只在 。 Sephadex的 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 ，不溶于水、鹽、弱酸和堿， 耐熱耐堿不耐酸。 反之 ,交聯(lián)劑的百分比低 ， 分離物質(zhì)的分子量大 。 OH 葡聚糖凝膠（商品名為 Sephadex） Sephadex的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)孔大小取決于交聯(lián)度 ， 交聯(lián)度的大小可在合成 Sephadex時控制加入交聯(lián)劑的百分比決定 。根據(jù)網(wǎng)孔不同可制成不同規(guī)格。 對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用 ，如芳香族化合物與脂蛋白等 。 缺 點 樣品和洗脫液的 粘度很低 。 ， 重復(fù)性好 。 其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 ，所以凝膠 本身不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 。 ?分子量大的物質(zhì)不能進入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以 大分子物質(zhì)遷移速度快 ； ?小分子物質(zhì)要通過凝膠網(wǎng)孔進入凝膠粒子內(nèi)部，所以 小分子物質(zhì)遷移速度慢 。 凝膠（ gel chromatography ）層析 ?單個凝膠珠本身象 “ 篩子 ” 。 層析柱 中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖 )類物質(zhì)，凝膠顆粒在合適的溶劑中浸泡，充分吸脹后裝入色譜柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。 凝膠層析亦稱 凝膠過濾、排阻色譜 或 分子篩層析 等。 ? 然后加樣品，再用適當?shù)娜軇┫疵摗? 層析因固相介質(zhì)不同又分為 離子交換層析 、凝膠層析 和 吸附層析 等。 ? 大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在 0℃ 或更低的溫度下進行。 溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響 ? 在一定溫度范圍內(nèi)，約 0~40℃ 之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加，但也有例外，如人的血紅蛋白從 0~