蛋白質(zhì)的分離純化ppt課件-文庫(kù)吧資料
2025-05-13 13:48本頁(yè)面
【正文】 膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。 在生物大分子的制備過(guò)程中 ， 除鹽 、 除少量有機(jī)溶劑 、 除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都可使用透析技術(shù) 。 29 6. 透析 ? 自 Thomas Graham 1861年發(fā)明透析方法至今已有一百多年 。 ? ② 沉淀效能高 ， 使用很少量的 PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子 。 ? 其中應(yīng)用最多的是 “ 聚乙二醇 ” ( Polyethylene Glycol 簡(jiǎn)寫為 PEG )， 它的親水性強(qiáng) ， 對(duì)熱穩(wěn)定 ，有廣泛的分子量 ， 在生物大分子制備中 ， 用的較多的是分子量為 6000～ 20220的 PEG。 ? 由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。 26 ? 具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離。 因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用 。 25 （ 2）有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn) ① 分辨能力比鹽析法高 ， 即一種蛋白質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀 。 24 ⑴ 基本原理 ①降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。 ? 3) 溫度的影響：對(duì)于蛋白質(zhì) 、 酶和多肽等生物大分子 ， 一般情況下 ， 可在室溫下進(jìn)行 。較適中的蛋白質(zhì)濃度是 ％～ ％，相當(dāng)于 25 mg/mL～ 30mg/mL。 血清 球蛋白 清蛋白 (NH4)2SO4 50%飽和度 飽和 析出 析出 23 （ 4）鹽析的影響因素 ? 1) 蛋白質(zhì)的濃度：若蛋白質(zhì)濃度過(guò)高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。 ? 4) 價(jià)格便宜 ， 廢液不污染環(huán)境 。 ? 3) 不易引起變性 ， 有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用 。 由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定 ，因而鹽析操作也要求在低溫下 （ 0～ 4℃ ）進(jìn)行 。 ? 加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水溶膠，蛋白質(zhì)分子聚集形成沉淀。 16 ⑴ 鹽析的基本原理 ? 蛋白質(zhì)溶液為親水溶膠體系，其穩(wěn)定因素為：水化膜和電荷。 ? ② 操作簡(jiǎn)單 、 安全 。 ? 缺點(diǎn)：分辨率低，產(chǎn)品雜質(zhì)多 15 1. 鹽析（ 中性鹽沉淀 ） 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過(guò)程稱為 “ 鹽析 ” 。 14 粗分級(jí)分離 ? 主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(kāi)。 13 ? 細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。 12 細(xì)胞器的分離 ? 細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，植物細(xì)胞還有葉綠體。 4) 冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法 。 11 3) 壓榨法：這是一種溫和的 、 徹底破碎細(xì)胞
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