【正文】 組織和細(xì)胞破碎以后，選擇適當(dāng)?shù)?緩沖液 把所要的蛋白質(zhì)提取出來。 ? 植物 組織和細(xì)胞 ， 由于具有由纖維素 、 半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁 ， 一般需要用與石英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄?研磨 的方法破碎 ， 液氮破碎或用 纖維素酶 處理也能達(dá)到目的 。 ? 然后根據(jù)不同的情況 ， 選擇適當(dāng)?shù)姆椒?， 將組織和細(xì)胞破碎 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)分離純化的 一般原則 分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為： 前處理 粗分級 分離 細(xì)分級 分離 前處理 (pretreatment) ? 分離純化某一 蛋白質(zhì) ， 首先要求把蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來 ， 并保持原來的天然狀態(tài) ， 不丟失生物活性 。這時，豆?jié){里就出現(xiàn)了許多白花花的東西了。 ? 點(diǎn)鹵時，由于鹽鹵是電解質(zhì)，它們在水里會分成許多帶電的小顆粒 ——正離子與負(fù)離子，由于這些離子的水化作用而奪取了蛋白質(zhì)的水膜，以致沒有足夠的水來溶解蛋白質(zhì)。 少量鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì)的加熱凝固。 (3) 重金屬鹽沉淀法 (4) 生物堿試劑和某些酸類沉淀法 (5) 加熱變性沉淀法 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。當(dāng)除去鹽后，又可溶解。 不可逆沉淀 沉淀蛋白質(zhì)的方法有以下幾種： (1) 鹽析法 ： 向蛋白質(zhì)溶液中加人大量的中性鹽 (硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等 )，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。 ?由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。 ? 可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。 ? 在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱?pH或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。 二、蛋白質(zhì)的沉淀 蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性 與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)， 是有條件的、相對的。 形成水化層： 分子表面上親水基團(tuán)在水溶液中能與水分子起水化作用 構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層： 分子表面上的可解離基團(tuán) ， 在適當(dāng)?shù)?pH條件下 ， 都帶有相同的凈電荷 ， 與其周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層 。 真溶液（ 1nm） 膠體溶液 懸浮液 (100nm） B、 分散相的質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷，互相排斥，不易聚集成大顆粒而沉淀。 分散相質(zhì)點(diǎn)在 膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定應(yīng)具備三個條件： A、 分散相的質(zhì)點(diǎn)大小在 1100nm范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)分子顆粒是分散相，水是分散介質(zhì)。g 1） ρ—溶劑密度（ 20℃ ， gmol 1 沉降系數(shù)（ s）： 單位（ cm）離心場里的沉降速度。 十二烷基磺酸鈉 原態(tài)蛋白質(zhì) 變性 ？ 磺酸基 極性親水 烷基 親油 （蛋白質(zhì)疏水區(qū)） 在聚丙烯酰胺凝膠中由于引入凝膠的 分子篩效應(yīng) ， 電泳遷移率與多肽鏈分子量的對數(shù)有下列關(guān)系： log Mr = a—bμR 式中 Mr為相對分子質(zhì)量 ， a、 b都是常數(shù) ，μR是相對遷移率： μR = 樣品遷移距離 /前沿 （ 染料 ） 遷移距離 實(shí)驗(yàn)測定時，以幾種相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物蛋白質(zhì)的 Mr的對數(shù)值對其 μR值作圖，根據(jù)待測樣品的 μR,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的Mr。 具有相同的構(gòu)象。 如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉 (SDS)和少量巰基乙醇，單體蛋白質(zhì)或亞基的多肽鏈處于伸展?fàn)顟B(tài)，此時 SDS以其烴鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合體。 logMr 三、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量 聚丙烯酰胺凝膠電泳，（簡稱 PAGE），也稱圓盤電泳，它以聚丙烯酰胺凝膠（單體丙烯酰胺 Arc和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺 Bis共聚而成）為支持物 。 V0 (outer volume)為外水體積，即存在于柱床中凝膠珠外孔隙的水相體積。 例如 ， 肌紅蛋白含鐵量為 ％ ， 其最低相對分子質(zhì)量可按下式算出： 最低相對分子質(zhì)量 = （ 鐵的原子量 /鐵的百分含量 ） X 100= （ ）X100=16700 二、凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量 ? 凝膠過濾原理 分子篩色譜 （凝膠過濾） 利用 Andrews的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)式： logMr = a/b—Ve/bVo Ve（ elution volume） 為某一溶質(zhì)組分的洗脫體積 。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)分子大小的測定 常用測定方法： 根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量 凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量 滲透壓法 沉降分析法（離心） 一、根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量 用化學(xué)分析方法測定出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量 ， 并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中只有一個鐵原子 。這種現(xiàn)象稱為 蛋白質(zhì)電泳 (Electrophoresis)。 ?在不同的 pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。可解離基團(tuán)主要來自側(cè)鏈上的功能團(tuán) . ? 對某一種蛋白質(zhì)來說，在某一 pH，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一 pH稱為 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) （與蛋白質(zhì)所含氨基酸種類有關(guān)）。 第一節(jié) 蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) ? 蛋白質(zhì)分子由氨基酸組成，在蛋白質(zhì)分子中保留著游離的末端 α—氨基和 α—羧基以及側(cè)鏈上的各種功能團(tuán)。第 七 章 蛋白質(zhì)的分離、純化和表征 研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和活性蛋白質(zhì)的功能，首先需要得到純的、沒有變性的蛋白質(zhì)樣品。 分離和純化蛋白質(zhì)的各種方法主要是利用蛋白質(zhì)之間各種特性的差異，包括： 、 、 、 。 蛋白質(zhì)也是一類兩性電解質(zhì) ，能和酸或堿發(fā)生作用。 ? 蛋白質(zhì)的 等離子點(diǎn) 是特征常數(shù) 蛋白質(zhì)的 電泳 ?在等電點(diǎn)時 (Isoelectric point pI)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。在大于等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動；在小于等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動。 電泳 ? 利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。 則可以由此計算出蛋白質(zhì)的最低相對分子質(zhì)量 。 它是自加樣品開始到該組分的洗脫峰（ 峰頂 ） 出現(xiàn)時所流出的體積 。測定出不能被凝膠滯留的大分子溶質(zhì)如藍(lán)色葡聚糖 —2022的洗脫體積可以決定 V0。 蛋白質(zhì)顆粒在各種介質(zhì)中電泳時，它的遷移率決定于它所帶的 電荷以及分子大小和形狀 (電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng) )。 結(jié)果： 所有的 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合體都具有相同的荷質(zhì)比。因此蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要 取決于它的相對分子質(zhì)量，而與原來所帶的電荷和分子形狀無關(guān)。 最準(zhǔn)確可靠的方法是 超離心法 （ Svedberg于1940年設(shè)計）：蛋白質(zhì)顆粒在 25~50*104 g離心力作用下從溶液中沉降下來。 s = ———— v ω2x v =沉降速度（ dx/dt） ω=離心機(jī)轉(zhuǎn)子角速度（弧度 /s） x =蛋白質(zhì)界面中點(diǎn)與轉(zhuǎn)子中心的距離（ cm） 沉降系數(shù)的單位常用 S， 1S=1 1013（ s） 蛋白質(zhì)分子量（ M）與沉降系數(shù)（ s）的關(guān)系 M = —————— RTs D（ 1－ Vρ） R—?dú)怏w常數(shù)（ 107ergs度 1） T—絕對溫度 D—擴(kuò)散常數(shù)（蛋白質(zhì)分子量很大，離心機(jī)轉(zhuǎn)速很快，則忽略不計） V—蛋白質(zhì)的微分比容（ m3ml1） s—沉降系數(shù) 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 與蛋白質(zhì)的沉淀 一、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)溶液是一種分散系統(tǒng)。就其分散程度而言蛋白質(zhì)溶液 屬于膠體系統(tǒng)。動力學(xué)上穩(wěn)定，能作不斷的布朗運(yùn)動。 C、 分散相的質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層（如水化層） 蛋白質(zhì) 溶液性質(zhì)： 蛋白質(zhì)分子顆粒在 1100nm范圍內(nèi) 。 + + + + + + + + + + + + + 蛋白質(zhì)溶液也和一般的膠體系統(tǒng)一樣具有 丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動以及不能通過半透膜 等性質(zhì)