zhou目的蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、檢測(cè)-wenkub.com
2025-05-04 12:14 本頁(yè)面
【正文】 ? 闡述目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建。 ? 將凝膠浸泡在染色液中，室溫在搖床上緩慢染色 4小時(shí)（或過(guò)夜）。 2. 過(guò)硫酸銨需新鮮配制，并注意濃度，否則影響膠凝固。 5）消化后混合等體積的 1 x SDS凝膠加樣緩沖液， 100度加熱 3min，室溫高速離心 1min，冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。 2）取 50ul過(guò)夜培養(yǎng)物接入 3ml含氨芐青霉素（ 50ug/ml）的 LB培養(yǎng)液， 37℃ 振蕩培養(yǎng) 2h以上，至對(duì)數(shù)中期（ A600=~）。 SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白質(zhì)分子間的天然的電荷差異。在樣品和凝膠中加入 SDS和還原劑后，強(qiáng)還原劑例如 β巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，通過(guò)加熱使蛋白質(zhì)解離。由于GST對(duì)谷胱甘肽的親和力非常高，因此可以利用谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹(shù)脂對(duì) GST及其融合蛋白進(jìn)行純化，最后通過(guò)含有游離的谷胱甘肽的緩沖液 ,洗脫結(jié)合的 GST融合蛋白。 ? T7 ? Kana ? pET 14b 實(shí)驗(yàn)原理 ? 目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá) – lacI q（ Lactose） – lacI是大腸桿菌中 lac 操縱子（ Operon）的調(diào)節(jié)基因，它所表達(dá)的阻遏蛋白是 lac 操縱基因（ Operator）的抑制因子，抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。 ? GFP（綠色熒光蛋白）是最常用的報(bào)告基因了，半乳糖苷酶，熒光素酶。 ? 目前常用的標(biāo)簽有 – 組氨酸標(biāo)簽（ HisTag） – 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ glutathione S transferase）標(biāo)簽（ GSTTag） – 硫氧還蛋白（ thioredoxin, Trx）標(biāo)簽 – 麥芽糖結(jié)合蛋白（ Maltose Binding Protein, MBP） – 蛋白質(zhì) A（ protein A） – 纖維素結(jié)合位點(diǎn)（ cellulose binding domain）標(biāo)簽等。 實(shí)驗(yàn)原理 ? 啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是對(duì)表達(dá)量有決定性影響的因素之一。 ? 3’端引物中 AC是隨機(jī)保護(hù)堿基， G GAT CC是 BamH I酶切位點(diǎn)，TAA是終止密碼子的反向互補(bǔ)序列，隨后是從編碼 16肽堿基序列的最后一個(gè)堿基開(kāi)始的反向互補(bǔ)序列。 ? 體內(nèi)很難分析單個(gè)蛋白質(zhì)的作用 ? 進(jìn)行大量表達(dá)和純化是為了在體外進(jìn)行研究 ? 應(yīng)用于蛋白純化、定位及功能分析等方面 實(shí)驗(yàn)原理 圖 pET14bHisTATEGFPp3816 peptides 融合蛋白 在 Hela細(xì)胞中的熒光顯微鏡檢測(cè)（ 400） 例
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